の有効性の評価<em> H。ピロリ</em同所性マウスモデルにおける膀胱癌の治療のための治療ツールとして>タンパク質HP-NAP
Summary
Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Abstract
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
Introduction
膀胱癌は、米国1で約75,000の新たな症例は毎年で、尿生殖路の最も一般的な癌の一つです。再発の高い割合は、膀胱癌治療のための最も高価な癌のいずれかを行う生涯フォローアップを必要とします。高品位NMIBC金標準的な治療はBCG膀胱内での免疫療法に続いて、トランス尿道的切除です。 BCGの抗腫瘍活性の正確なメカニズムは完全には解明されないままであるが、それは、Tヘルパー（TH）1と、細胞傷害性T（TC）1細胞が濃縮された細胞性免疫応答の活性化のために重要であることが認められています治療2の成功。
BCGはNMIBCのための選択の治療法が残っているという事実にもかかわらず、治療に反応しない患者の割合が高いです。しかも、それは多くの副作用を引き起こす可能性があります。処理された腫瘍の約70％は、筋肉侵襲性の形態に〜15％の進捗状況をいくつかの時間後に再発し、病気。 BCG治療に関連する他の副作用は排尿障害、膀胱炎や腎感染3-6を含みます。
新たな治療戦略の開発は、最初のin vitroでの評価以下、考慮に前臨床モデルの使用を取る必要があります。これは、その微小環境大幅に処理し、その開発と応答性に影響を与えることができる腫瘍に特に関連します。
過去10年間、私たちはHP-NAP、細菌ヘリコバクター·ピロリによって産生されるタンパク質の免疫調節活性の複数の側面に対処している、最初に多形核細胞（PMNの）7の内皮接着を促進することができるように同定しました。構造的には、HP-NAPは、飢餓状態の条件（DPS）ファミリー8下のDNA保護タンパク質に属し、12量体シェル内に配置された12の同一のサブユニットから構成されています。
我々は、HP-NAPであることが実証されていますインビトロおよびインビボの両方で 9~10、のTh1表現型へのTリンパ球の分化を駆動するための責任強い免疫調節活性を有するToll様受容体（TLR）2アゴニスト。この活動のおかげで、HP-NAPは、アレルギー性喘息11のマウスモデルにおいて、より有益なTh1応答にTh2免疫応答をリダイレクトすることができます。
HP-NAPのにTh1依存性の抗腫瘍性を評価するために、我々は、BCG投与の影響を評価するためのオドネルと同僚12によって、数年前に開発膀胱癌のマウスモデルを利用しました。
このプロトコルでは、我々はHP-NAPは、膀胱癌に対する強力な抗腫瘍ポテンシャルを持っていること、およびHP-NAP投与の有効性は、（インターフェロンを生産両方のTh1とTc1のリンパ球、腫瘍および所属リンパ節内に、有意な蓄積と平行していることを実証しますIFN）は13-γ </SUP>。 HP-NAP-処置したマウスから単離された腫瘍は、より多くの壊死および未処理の対応物より少ない血管新生を示しました。
本報告書では、動物の準備、それらの尿道カテーテル、膀胱粘膜への細胞の付着、および腫瘍細胞の注射のために必要な化学燃焼を詳述、stepbystepプロトコルを提供します。また、膀胱癌の治療のために開発された任意の治療薬の原型とみなすことができるHP-NAPの局所投与を記載しています。制御とHP-NAP-処置動物から単離された腫瘍を比較することによって得られた証拠はないだけで、HP-NAPは、膀胱癌免疫療法のための優れた候補だけでなく、実験設定の一般的な有効性とすることができるという事実を強調しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
癌治療の進歩の大部分は、臨床試験を開始する前に、動物モデルでテストを必要とします。動物モデルを利用して、 インビボでの腫瘍生物学を研究する可能性は、異なる治療法の評価を可能とする、癌の発病を調査する研究者のための重要なツールです。同所モデルは、腫瘍モデルを設定し、それらが天然に存在する腫瘍16の環境を模倣するためにするための細胞株の膨大な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、者協会イタリアーナあたりラRicercaスルCancro、大学のイタリアの研究省、PrinプロジェクトとPROGETTIディRicercaディアテネオ、付与N°CPDA137871、Fondazione Cariploでサポートされていた、NはMDBに2011から0485を°、およびFinanziamento Giovaniによって付与ガイアCodoloにStudiosi、パドヴァ大学、。
Materials
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System
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