تقييم فعالية<em> H. بيلوري</em> البروتين HP-NAP كأداة علاجية لعلاج سرطان المثانة في مثلي فأري موديل
Summary
Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Abstract
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
Introduction
سرطان المثانة هو واحد من أكثر أنواع السرطان شيوعا في الجهاز البولي التناسلي، مع ما يقرب من 75،000 حالة جديدة كل عام في الولايات المتحدة الأمريكية 1. تتطلب معدلات عالية من تكرار مدى الحياة المتابعة، مما يجعل سرطان المثانة واحدة من أغلى أنواع السرطان لعلاج. علاج الذهب القياسية لعالية الجودة NMIBC هو بتر عبر الإحليل، تليها العلاج المناعي إينترفسكل مع BCG. على الرغم من أن الآلية الدقيقة للنشاط المضادة للورم من BCG يبقى أن توضح تماما، ومن المتفق عليه أن تفعيل استجابة بوساطة الخلايا المناعية المخصب في T المساعد (ث) 1 والسامة للخلايا T (ح) 1 الخلايا هو أمر حاسم ل نجاح العلاج 2.
على الرغم من أن BCG يبقى العلاج الأمثل لNMIBC، وهي نسبة عالية من المرضى لا يستجيبون للعلاج. علاوة على ذلك، فإنه يمكن أن يسبب عددا من الآثار الجانبية: حوالي 70٪ من الأورام تعامل تتكرر بعد مرور بعض الوقت والتقدم ~ 15٪ إلى النموذج العضلات الغازية للالمرض. الآثار الجانبية الأخرى المرتبطة العلاج BCG تشمل عسر البول، التهاب المثانة والتهاب الكلى 3-6.
تطوير استراتيجيات علاجية جديدة يجب أن تأخذ في الاعتبار استخدام نماذج ما قبل السريرية، بعد الأولي في المختبر التقييم؛ هذا أهمية خاصة في الأورام التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير تنميتها والاستجابة للعلاج المكروية.
على مدى العقد الماضي، ونحن قد تناولت جوانب متعددة من النشاط تحوير المناعة من HP-NAP، وهو بروتين تنتجه بكتيريا هيليكوباكتر بيلوري، حدد في البداية بأنه قادر على تعزيز التصاق الخلايا البطانية النوى (PMNs) 7. هيكليا، HP-NAP ينتمي إلى البروتين لحماية الحمض النووي في ظل ظروف التجويع (DPS) الأسرة (8) ويتكون من 12 مفارز متطابقة مرتبة في قذيفة dodecameric.
لقد أثبتنا أن HP-NAP هومستقبلات تول مثل (TLR) 2 ناهض، مع نشاط تحوير المناعة القوي التي تقف وراء تمايز اللمفاويات التائية نحو النمط الظاهري TH1، سواء في المختبر والمجراة 10/09. في فضيلة لهذا النشاط، HP-NAP غير قادرة على توجيه الاستجابة المناعية TH2 في الاستجابة أكثر فائدة TH1 في نموذج الفئران من الربو التحسسي 11.
لتقييم القدرة المضادة للورم TH1 التي تعتمد من HP-NAP، اتخذنا الاستفادة من نموذج الفأر من سرطان المثانة وضعت قبل عدة سنوات من قبل أودونيل وزملاؤه (12) لتقييم أثر إدارة BCG.
مع هذا البروتوكول، علينا أن نبرهن على HP-NAP لديها امكانات المضادة للورم قوية ضد سرطان المثانة وأن فعالية إدارة HP-NAP يوازي تراكم كبير، داخل الورم والغدد الإقليمي العقد، كل من Th1 و TC1 الخلايا الليمفاوية إنتاج الانترفيرون ( IFN) -γ 13 </سوب>. وأظهرت أورام معزولة من الفئران التي عولجت HP-NAP-مزيد من نخر والأوعية الدموية أقل من نظيره غير المعالجة.
يقدم هذا التقرير بروتوكول stepbystep، تفاصيل إعداد الحيوانات، قسطرة الإحليل، وحرق الكيميائية اللازمة لمرفق من الخلايا إلى الغشاء المخاطي المثانة، وحقن الخلايا السرطانية. نحن أيضا وصف الإدارة الموضعية من HP-NAP التي يمكن اعتبارها نموذجا أوليا من أي العوامل العلاجية المتقدمة لعلاج سرطان المثانة. الأدلة التي تم الحصول عليها عن طريق مقارنة أورام معزولة عن السيطرة وHP-المعالجة NAP الحيوانات ويؤكد ليس فقط حقيقة أن HP-NAP يمكن أن يكون مرشحا جيدا للعلاج مناعي سرطان المثانة، ولكن أيضا فعالية العامة للالتجريبية اقامة.
Protocol
Representative Results
Discussion
معظم السلف في علاج السرطان تتطلب اختبارات في النماذج الحيوانية قبل بدء التجارب السريرية. إمكانية دراسة بيولوجية الورم في الجسم الحي، والاستفادة من النماذج الحيوانية، يمثل أداة حاسمة للباحثين التحقيق التسبب بالسرطان، مما يتيح تقييم أساليب علاجية مختلفة. لا تز?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل ASSOCIAZIONE الإيطالية في لا يسر كل من Ricerca سول Cancro، الوزارة الإيطالية للجامعة والبحوث والمشاريع نسخ م وPROGETTI دي يسر كل من Ricerca دي أتينيو، منح N ° CPDA137871، FONDAZIONE Cariplo، منح N ° 2011-0485 إلى MDB، وFinanziamento جيوفاني Studiosi، جامعة بادوا، لغايا Codolo.
Materials
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. . CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L. Complications of bacillus Calmette-Guerin immunotherapy. Urol Clin North Am. 19, 565-572 (1992).
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D’Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
