Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
Durante la infección y la inflamación, los monocitos circulantes abandonan el torrente sanguíneo y migran hacia los tejidos, donde se diferencian en macrófagos. Los macrófagos expresan receptores de superficie de tipo Toll (TLRs), que reconocen patrones moleculares conservados a través de la evolución en una amplia gama de microorganismos. TLRs jugar un papel central en la activación de macrófagos que generalmente se asocia con la alteración de la expresión génica. Los macrófagos son críticos en muchas enfermedades y se han convertido en objetivos atractivos para la terapia. En el siguiente protocolo, se describe un procedimiento para aislar los macrófagos peritoneales murinos utilizando medio de tioglicolato de Brewer. Este último será impulsar la migración de monocitos en el peritoneo, en consecuencia esto elevará el rendimiento de los macrófagos por 10 veces. Varios estudios se han llevado a cabo utilizando la médula ósea, el bazo o peritoneales macrófagos derivados. Sin embargo, los macrófagos peritoneales se mostró a ser más maduro tras el aislamiento y son más estables en su funcionaldad y fenotipo. Por lo tanto, los macrófagos aislados de la cavidad peritoneal murino presentan una importante población de células que pueden servir en diferentes estudios inmunológicos y metabólicos. Una vez aislado, los macrófagos fueron estimulados con diferentes ligandos de TLR y en consecuencia se evaluó la expresión génica.
Introduction
El sistema reticuloendotelial fagocítica se compone de células en diversos tejidos y órganos tales como la médula ósea, la sangre, el hígado y el bazo. Los macrófagos se distribuyen ampliamente en todo el cuerpo, donde principalmente participan en innata y adaptativa la respuesta inmune para controlar las infecciones y claros. Además de su papel en la defensa del huésped, los macrófagos también juegan un papel importante en la cicatrización de heridas y en el mantenimiento de la homeostasis del tejido 1,2. Además, los macrófagos no sólo son importantes para la función inmune, pero también participan activamente en la homeostasis del hierro 3. En el cuerpo, aproximadamente 80% de hierro está presente en la hemoglobina dentro de los eritrocitos, que cuando senescentes son fagocitadas por los macrófagos 4. Todos los días, estos macrófagos reciclan 25 mg de hierro eritrocitos derivados y proporcionar su transporte en el plasma 5. Por otra parte, durante la infección y la inflamación, los macrófagos pro-inflamatorias secuestran hierro sérico para reducir DISPONIBIL hierrodad a los patógenos, tanto a nivel sistémico y local 6-8. Además, los estudios han demostrado que los macrófagos y principalmente los hepatocitos producen un péptido antimicrobiano llamado hepcidina que es considerado el maestro regulador del metabolismo del hierro 9, 10. La hepcidina se incrementa principalmente por estímulos inflamatorios y es parcialmente responsable de secuestro de hierro en los macrófagos en inflamación crónica 11-13. Como expresión de hepcidina en los macrófagos no se entiende muy bien, hemos estudiado el posible papel de los receptores tipo Toll (TLR) en este reglamento. Los TLRs se encuentran principalmente en los macrófagos y juegan un papel central en su activación. Además, LPS expresión de hepcidina inducida en el hígado es dependiente de TLR4 13. Por lo tanto, para ejecutar nuestro estudio, hemos utilizado un método basado en el aislamiento de macrófagos peritoneales murinos.
Líneas celulares de macrófagos se utilizan ampliamente en espárrago macrófagoss; no obstante, la cultura extendida puede provocar la pérdida de genes y la disminución de las funciones inmunes en estas líneas celulares. Por lo tanto, el aislamiento de los macrófagos de la cavidad peritoneal es crucial.
La cavidad peritoneal de ratón presenta un sitio ideal para cosechar los macrófagos 13-15. Macrófagos peritoneales murinos aislados son convenientes para varios estudios con respecto a su función inmunológica. Sin embargo, el número de macrófagos en el peritoneo es insuficiente para estudios extensos y se estima alrededor de 1 x 10 6 macrófagos por ratón. Por lo tanto, para aumentar la producción de macrófagos, un agente de provocar estéril tal como tioglicolato se inyectó en la cavidad peritoneal anterior a la cosecha de células. Después de la inyección de tioglicolato, el rendimiento de los macrófagos por ratón se incrementó en 10 veces. A pesar del aumento en los macrófagos rendimiento, tioglicolato actos medianas de cerveza como un irritante que induce una respuesta inflamatoria, lo que resulta en el reclutamiento de macrófagos, que may pero no es necesario afectar a la expresión génica. Por lo tanto, un grupo de control que consiste en macrófagos no tratados debe ser incluido en cada experimento. En nuestras manos, la expresión de hepcidina que está muy estimulada por la inflamación no se detectó en tioglicolato no tratado provocada macrófagos peritoneales. Por otra parte, los estudios han demostrado que tioglicolato de Brewer recluta numerosos macrófagos, pero no activa ellos 16. Por otro lado, tioglicolato de Brewer suscitó macrófagos mostraron un aumento en la enzima lisosomal, pero una disminución en matar microorganismos ingeridos 17. Sin embargo, la capacidad fagocítica no se vio afectada en comparación con los macrófagos no-suscitó 16.
Una vez cultivadas en platos, los macrófagos peritoneales se convierten adherente, por lo tanto permitiendo su separación de otro tipo de células aisladas de la cavidad peritoneal. Posteriormente, los macrófagos aislados fueron desafiados con diferentes agonistas de TLR.Finalmente, el ARNm se extrajo de las células cultivadas y la expresión génica se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Los macrófagos son cruciales para la supervivencia y proporcionan un objetivo tentador para manipular el anfitrión de objetivos inmunológicos. El descubrimiento de TLRs y otras moléculas de reconocimiento han llevado a cabo los macrófagos para el centro de debate inmunológica. Los macrófagos responden a una variedad de estímulos, incluyendo citoquinas, moléculas de daño asociado moleculares patrón (20) amortigua y moléculas asociadas con grupos de patógenos (PAMPs) 21. Estas respuestas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC, conceder ninguna 298.515-2011). AL es el destinatario de un Ph.D. beca de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) y MS fue apoyado por una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR, subvención no. MOP123246).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
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