Nous décrivons ici un protocole simple pour isoler les macrophages péritonéaux murins. Cette procédure est suivie d’une extraction de l’ARN pour effectuer une analyse de l’expression génique lors de la stimulation des récepteurs de type Toll.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Isolement d'anticorps murins péritonéale macrophages pour effectuer Analyse expression génique Sur Toll-like récepteurs Stimulation
Dans cet article
Résumé
Résumé
Lors de l'infection et l'inflammation, les monocytes circulants quittent la circulation sanguine et migrent dans les tissus, où ils se différencient en macrophages. Les macrophages expriment des récepteurs de surface Toll-like (TLR), qui reconnaissent des motifs moléculaires conservés à travers l'évolution dans une large gamme de micro-organismes. TLR jouent un rôle central dans l'activation des macrophages qui est généralement associée à l'expression du gène altération. Les macrophages sont essentiels dans de nombreuses maladies et sont apparus comme des cibles attrayantes pour la thérapie. Dans le protocole suivant, nous décrivons une procédure d'isoler les macrophages péritonéaux murins en utilisant un milieu thioglycollate de Brewer. Ce dernier va stimuler la migration des monocytes dans le péritoine, en conséquence, cela posera des macrophages rendement de 10 fois. Plusieurs études ont été effectuées en utilisant la moelle osseuse, la rate ou péritonéale macrophages dérivés. Toutefois, les macrophages péritonéaux sont avérés plus mature sur l'isolement et sont plus stables dans leur fonctionnellité et le phénotype. Ainsi, macrophages isolés de la cavité péritonéale murin présentent une population de cellules importantes qui peuvent servir dans différentes études immunologiques et métaboliques. Une fois isolé, les macrophages ont été stimulées avec les différents ligands de TLR et par conséquent l'expression génique a été évaluée.
Introduction
Le système réticulo-endothélial phagocytaire est composé de cellules dans différents tissus et organes tels que la moelle osseuse, le sang, le foie et la rate. Les macrophages sont largement distribués autour du corps, où ils participent notamment à des innées et adaptatives des réponses immunitaires à contrôler et infections claires. En plus de leur rôle dans la défense de l'hôte, les macrophages jouent également un rôle important dans la cicatrisation des plaies et dans le maintien de l'homéostasie tissulaire 1,2. En outre, les macrophages ne sont pas seulement importants pour la fonction immunitaire, mais participent aussi activement à l'hom....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec le Conseil canadien sur les lignes directrices des soins des animaux après l'approbation par le Comité institutionnel de protection des animaux du Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Isolement, identification, et de la culture des macrophages murins péritonéale
- Préparer le milieu thioglycollate de 3,8% brasseur. Pour ce faire, suspendre 38 g de milieu au thioglycolate dans 1000 ml d'eau distillée. Apportez solution à ébullition pour dissoudre complètement le milieu. Stériliser par autoclavage à 121 ° C pendant ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Nous avons caractérisé les premier macrophages péritonéaux murins isolés par cytométrie de flux. Pour ce faire, nous avons utilisé (F4 / 80) anticorps qui reconnaissent spécifiquement des marqueurs seulement exprimées par les macrophages. Cette caractérisation est nécessaire pour déterminer le pourcentage de macrophages isolés et de les distinguer entre les cellules obtenues au cours du processus d'isolement. Comme le montre la (figure 1), le pourcentage de cellules exprimant l'antigène F4 / 80 .......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Les macrophages sont cruciales pour la survie et fournissent une cible tentante pour manipuler l'hôte pour objectifs immunologiques. La découverte des TLR et d'autres molécules de reconnaissance ont mené les macrophages au centre du débat immunologique. Les macrophages répondre à une variété de stimuli, y compris des cytokines, des molécules associées à des dommages moléculaires amortit motif (20) et des molécules associées à des groupes d'agents pathogènes (PAMP) 21. Ces différentes ré.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été financé par une subvention du Conseil de recherches en génie du Canada en sciences naturelles et (CRSNG, accorder aucune 298515-2011). AL est le récipiendaire d'un doctorat bourse du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et, MS et a été soutenu par une subvention des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC, accorde pas. MOP123246).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 souris | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, États-Unis) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70 % d’éthanol | |||
| 10 % de sodium pentobarbital (utilisé pour l’anesthésie des souris (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (DPBS), placée sur de la glace et servira à récolter les macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI milieu 1640 (Supplément de pénicilline, de streptomycine, de L-glutamine et de sérum de veau fœtal à 10 %). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| Seringues de 1 et 5 ml | BD USA (NJ) | ||
| Plaques à 6 puits | Corning Incorporated (NY, États-Unis) | MCT-150-C | |
| Lipoprotéine bactérienne Pam3CSK4 (0,5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, États-Unis) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine&ndash ; acide polycytidylique (Poly(I :C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, États-Unis) | TLRL-PIC | |
| LPS d’Escherichia coli 055 :B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, États-Unis) | L2880 | |
| Flagelline purifiée de Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, États-Unis) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotéine synthétique FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, États-Unis) | TLR-FSL | |
| ARNss dérivé de l’ARNss à longue répétition terminale du VIH-140 (1 &mu ; g/ml) | InvivoGen (San Diego, États-Unis) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucléotide ODN1826 (1 &mu ; M) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| Aiguilles 20 G et 23 G | BD USA (NJ) | ||
| Pince | |||
| ciseaux | |||
| Tubes coniques de 50 ml posés sur glace | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Tampon de lyse des globules rouges | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Centrifugeuse | |||
| Hémocytomètre | |||
| F4/80 | anticorps BIO-RAD ( CA, USA) | ||
| Anticorps CD16/CD32 | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Cytomètre | en fluxCompteur Scoulter Epics Elite, Coulter, (Hialeah, FL, USA) | ||
| Tubes Eppendorf de 1,5 ml | Axygen Scietific (CA, USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Alcool isopropylique | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| Éthanol à 75 % (dans l’eau traitée au DEPC) | Alchohols commerciaux (QC, Canada) | 17394 | |
| Eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle à 0,01 % (DEPC) (laisser reposer toute la nuit et autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Système RT-PCR Omniscript | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
Références
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
