के अलगाव के लिए एक अनुकूलित संवर्धन तकनीक<em> Arthrobacter</em> जीवाणुभोजी प्रजाति मिट्टी का नमूना आइसोलेट्स से
Summary
We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.
Abstract
Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.
Introduction
मिट्टी के वातावरण में Arthrobacter प्रजातियों की सर्वव्यापकता मेजबान जीवाणु की इस प्रजाति से अलग किया जा रहा करने में सक्षम फगेस की एक विशाल संख्या और विविधता प्रदान करता है। Acintobacteriaceae परिवार के बैक्टीरियल सदस्यों atrazine और विभिन्न अन्य कीटनाशकों और herbicides 1,2,3 की तरह अड़ियल यौगिकों अपमानजनक के अपने catabolic रास्ते के लिए सबसे उल्लेखनीय हैं। सबसे अनुसंधान Arthrobacter के पर्यावरण उपभेदों का उपयोग किया गया है, हालांकि, इस जीनस के नैदानिक आइसोलेट्स रक्त, मूत्र, आँखें, और सभी वंशावली विविधता चार प्रदर्शित करने के लिए कई अन्य मानव स्रोतों में पाया जाता है।
Arthrobacter बैक्टीरिया पर शोध के लिए एक नहीं बल्कि व्यापक शरीर नहीं है, केवल कुछ अध्ययनों से इस विविध जीनस के सदस्यों को संक्रमित करने में सक्षम फगेस पर रिपोर्ट। दिलचस्प बात यह है, हालांकि Arthrobacter पर पहले से किए गए कार्य <ऐसी मिट्टी की टाइपिंग के रूप में कई महत्वपूर्ण अलग विषयों पर छू फगेसउन्हें> Arthrobacter प्रजातियों सक्रिय कीचड़ उपचार संयंत्रों 6 में हानिकारक फोम कम करने, और कार्य स्थल विशिष्ट पुनर्संयोजन और इंटिग्रेस जीन 7 उजागर करने का उद्देश्य के साथ 5, औद्योगिक उपयोग करता है।
विभिन्न संवर्धन तकनीक प्रोटोकॉल शुद्ध फेज Arthrobacter प्रजातियों में आइसोलेट्स उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया गया है। प्रारंभिक प्रक्रियाओं केवल संक्रमित करने ए में सक्षम फगेस के लिए 8 वर्ष से अधिक जन्म देने की अवधि के लिए निकोटीन लवण की तरह जोड़ा विषाक्त एजेंटों के साथ मिट्टी की incubations शामिल globiformis। अस्थिर ऑर्गेनिक्स पट्टिका परख तकनीक के माध्यम से detectable फगेस निर्माण करने के लिए दिखाई दिया साथ मिट्टी का उपयोग किया स्टडीज लंबा ऊष्मायन अवधि 8 को छोड़ते हुए, percolated। दिलचस्प बात यह है, हालांकि प्रत्यक्ष चढ़ाना जैसी तकनीक कम सफलता दर के साथ पिछले अध्ययनों का हवाला देते हुए, अभी भी जांचकर्ताओं 5 से एक विशेष रूप से कम सफलता दर जबकि कई फगेस को जन्म देने के अतीत में इस्तेमाल किया गया था <s> आठ अप।
कुल मिलाकर, अतीत में इस्तेमाल अलगाव की तकनीक सबसे आम एरोबिक मिट्टी का प्रतिनिधित्व Arthrobacter जीनस के बावजूद व्यवहार में थोड़ा प्रभावकारिता होने के लिए उल्लेखनीय थे प्रकृति 4,9 में अलग-थलग, पानी और मिट्टी से फगेस के लिए अलग वैन Twest और Kropinski 10 उपस्थित संवर्धन विधियों पर्यावरण बैक्टीरियल आइसोलेट्स लेकिन इन संवर्धन तकनीक को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल पहले तकनीक से अनुकूलित Arthrobacter फगेस अलग-थलग करने में अक्षम साबित हुई। यहाँ वर्णित विधि का उद्देश्य जल्दी संवर्धन तरीकों को लगातार और प्रभावी ढंग से इस जीवाणु जीनस से फगेस अलग-थलग करने के साथ जुड़े पिछले तकनीकी चुनौतियों पर काबू पाने, Arthrobacter फगेस अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि "अवधारणा के सबूत 'दिखाने के लिए है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले कई प्रयासों के Arthrobacter मेजबानों संक्रमित करने में सक्षम फगेस को अलग करने के बावजूद, हम मानक संवर्धन प्रक्रियाओं का उपयोग थोड़ी सफलता मिली। विकसित और पर्यावरण के नमूनों से फगेस को समृद्ध करने के…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए अनुदान उच्च शिक्षा के लिए दक्षिण पेंसिल्वेनिया कंसोर्टियम और Cabrini कॉलेज ऑफ साइंस विभाग द्वारा प्रदान किया गया। अतिरिक्त धन और समर्थन आर्केडिया विश्वविद्यालय और Immaculata विश्वविद्यालय से आया था। हम विशेष रूप से कृपया हमारी पृथक फगेस की इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म छवियों को लेने के लिए सेंट जोसेफ विश्वविद्यालय में डॉ करेन Snetselaar धन्यवाद। अतिरिक्त सहायता जीनोमिक्स और विकासवादी साइंस (सागर-फगेस) कार्यक्रम में आगे बढ़ने के हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एजुकेशन एलायंस फेज शिकारी द्वारा प्रदान की गई थी।
Materials
| LB Broth powder | Fisher | BP9722-2 | It's best to order these in bulk. |
| Granulated Agar | Fisher | BP1423-2 | It's best to order these in bulk. |
| 0.22 um syringe filters | Fisher | 09-719A | |
| .22 um buchner filters | Fisher | 430320 | More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube. |
| Eppendorf Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 5 mL pipets individual | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 mL conical tubes | Fisher | 76002844 | |
| 15 mL conical tubes | Fisher | 76002845 | |
| 10 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10K | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher | 1001-824 |
References
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
- Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
- Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).
- Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).
- Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a. Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).
- Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).
- Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).
- Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
- Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).
- Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).
- Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
