Athymic עכברוש מודל להערכת הנדסי קדמי צולב גידים שתלי
Summary
Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.
Abstract
Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.
Introduction
קרע של הרצועה הצולבת הקדמית (ACL) הוא אחד מרוב הפציעות נפוצות רצועה של הברך 1. בגלל ACL של הקרע אינו יכול לרפא ללא התערבות כירורגית, המגבלות בפעולות יומיומיות, כמו גם השתתפות בספורט לנסוע על 175,000 חולים לעבור ניתוח בכל שנה 2, עם עלות משוערת של מליארד דולרים בשנה 3. נכון לעכשיו, או autograft או גיד שתל משמש לשחזור רצועה. למרות שניתן להשיג אחוזי הצלחה גבוהה בשתי החלפת autograft ושתל, סיבוכים רציניים קשורים לאפשרויות שחזור אלה 4. רקמת autograft קשורה בתחלואת אתר תורם ומוגבלת באספקה, במיוחד במקרים של קרע מחדש או פגיעה רב-ligamentous. מצד השני, רקמת שתל מקושרת עם שילוב מושהה שתל, תגובה דלקתית שלילית, תיאורטי זיהומיות סיכון, וsupp המוגבלly 5. שתלים שאינם מתכלים סינטטיים שפותחו בשנתי ה -1970 ו -1980 אך הקשו על ידי קרע מוקדם שתל, תגובות גוף זר, osteolysis, וקרום מוח 6. כתוצאה מהחששות כבדים אלה, אין כיום שתלים סינטטיים זמינים לשימוש קליני בארצות הברית.
בשל מגבלות אלה עם אפשרויות שתל קיימות והתפתחויות האחרונות בביולוגיה, הנדסה, ורפואת רגנרטיבית, חלה התעניינות רבה בפתרון רקמות מהונדס להשתלת ACL. אסטרטגיות הנדסת רקמות הנוכחיות להעסיק חומרים ביולוגיים וסינטטיים מתכלים כדי לאפשר ingrowth רקמות מארח, תוך הימנעות מהמגבלות הקשורות להשתלת חומר סינטטי קבוע 7.
Polycaprolactone (PCL) הוא פולימר מתכלה כי הוא ה- FDA אישר למספר היישומים הרפואיים כוללים מחסום הידבקות ופצע הלבשת 8, שהיה used במגוון רחב של יישומים, כולל כלי דם, עצמות, סחוס, עצבים, עור, והנדסת רקמות הוושט 5,9-16. biocompatibility החיובי, יחסית ארוך מחצית חיים, חוזק מכאני נאות, וגמישות גבוהה לתרום ב- vivo לפופולריות של פולימר זה בהנדסת רקמות. במודל מכרסם של ריפוי פצעים, PCL electrospun המושתל הוצג להיות לא-חיסוני ולהשתלב ברקמה מקומית ללא תופעות לוואי 13. תמונת SEM של PCL electrospun מוצגת באיור 1.
עם נוכחי סטנדרטים, יעילות FDA רגולציה ובטיחות בשני מודלים של בעלי החיים הקטנים וגדולים שהיה נדרש לPCL או כל שתל ACL מהונדס אחר לעבור לניסויים קליניים בארצות הברית. בנוסף, תנאי in vivo יכולים לעתים להגדיל את המאפיינים של שתל ACL במבחנה רקמה מהונדס. מודל עכברים של שחזור ACL אוטולוגי עם digitor המכופףאממ גיד longus כבר תואר קודם לכן, שבי ACL האם נותק, הירך ושוקת מנהרות שנקדחו, והשתל עבר ומאובטח במקום עם תפר 17-22. במאמר זה, נתאר שינוי של מודל זה להערכת תחליפי ACL מהונדס ולא לשיקום מבוסס autograft (איור 2).
למרות שמודלים של בעלי חיים רבים קיימים עבור הנדסת רקמות רצועה, העכברוש הוא יתרון בהשוואה לדגמים גדולים יותר עבור מספר הסיבות. יתרונות אלה כוללים גידול קל יותר וטיפול, שיקולים אתיים פחות, ו17,23 עלות מופחתת. בנוסף, מודל החולדה כבר בשימוש נרחב כמודל להתחדשות רקמות אורתופדים, כוללים סחוס, גידים, והנדסת רקמות עצם 24. בפרט, חולדות בעירום athymic נבחרו בשל חוסר התגובה חיסונית תא 25, ומאפשרות לo השתלת סופו של הדברתאי תורם xenogeneic f במודל זה כדי לשפר עוד יותר את השתל המהונדס בעתיד. במאמר שיטות זה, אנו מתארים את הייצור והשתלה כירורגית של acellular, שתל פולימרים מתכלה במודל עכברים athymic של שחזור ACL.
Protocol
Representative Results
Discussion
פציעות ACL הן מצב שכיח בניתוח אורתופדי ספורט, עם אפשרויות מוגבלות לשיקום בעת הנוכחית. על מנת לפתח תחליף רקמות מהונדסות מתאים לACL שיאפשר התחדשות in vivo, נדרש מודל חיה מתאים. במחקר זה, הייצור של שתל מהונדס מתכלה מתואר, כפי שהשתלתה בvivo תוך שימוש במודל לשחזור של שחזו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לגבריאל ירום ומיכאל Yeranosian על תרומתם לחזרות הטכנית קודמות של הפרויקט הזה. פרויקט זה מומן על ידי OREF מטפל מדען ההדרכה גרנט (NL), HH לי כירורגי מענק מחקר (NL), ותיקי המינהל BLR & D סקירת הצטיינות I01 1 BX00012601 (DM) ושלד ושרירי השתלת קרן פרס חוקר צעיר (FP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000) | Lactel Absorbable Polymers | Custom synthesized polymer to desired molecular weight | |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol | Sigma-Aldrich | 105228 | Solvent for PCL polymer |
| 18G x 1 1/2"bevel needle | BD Medical | 305196 | |
| Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702101 | |
| VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver | Microgeo USA | VLS2.30 | |
| Expanded Plasma Cleaner 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification |
| PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml | Advanced Biomatrix | 5015-A | Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1N NaOH 1:9 in 1x PBS |
| Suture, 5-0 Vicryl | Henry Schein | 1086471 | |
| Suture, 4-0 Vicryl | Henry Schein | 6540072 | |
| Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch) | Fisher Scientific | 8940 | |
| Buphrenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | B9275 | Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control |
| Ampicillin, injectable | Henry Schein | 1185678 | Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure |
| K-wire, 1.6 mm | Spectrum Surgical | SI040062 | |
| Keith Needle, Straight 1 1/2" | Delasco Dermatology Lab & Supply | KE-112 | |
| Immunocal Decalcifying Solution | Fisher Scientific | NC9491030 | |
| Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer) | US Dental Depot | OPTICRYL 100410 | |
| Instron Model 5564 Tensile Testing Machine | Instron | 5564 | Any comparable tensile testing apparatus is suitable |
References
- Fetto, J. F., Marshall, J. L. The natural history and diagnosis of anterior cruciate ligament insufficiency. Clin Orthop Relat Res. (147), 29-38 (1980).
- Kim, Y. M., Lee, C. A., Matava, M. J. Clinical results of arthroscopic single-bundle transtibial posterior cruciate ligament reconstruction: a systematic review. Am J Sports Med. 39 (2), 425-434 (2011).
- Andersson, C., Odensten, M., Gillquist, J. Knee function after surgical or nonsurgical treatment of acute rupture of the anterior cruciate ligament: a randomized study with a long-term follow-up period. Clin Orthop Relat Res. (264), 255-263 (1991).
- Klimkiewicz, J. J., Petrie, R. S., Harner, C. D. Surgical treatment of combined injury to anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament, and medial structures. Clin Sports Med. 19 (3), 479-492 (2000).
- Petrigliano, F. A., McAllister, D. R., Wu, B. M. Tissue engineering for anterior cruciate ligament reconstruction: a review of current strategies. Arthroscopy. 22 (4), 441-451 (2006).
- Groot, J. H., et al. Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction and meniscal prostheses. Biomaterials. 17 (2), 163-173 (1996).
- Leong, N. L., Petrigliano, F. A., McAllister, D. R. Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomed Mater Res A. 102 (5), 1614-1624 (2014).
- Duling, R. R., Dupaix, R. B., Katsube, N., Lannutti, J. Mechanical characterization of electrospun polycaprolactone (PCL): a potential scaffold for tissue engineering. J Biomech Eng. 130 (1), 011006 (2008).
- Shao, Z., et al. Polycaprolactone electrospun mesh conjugated with an MSC affinity peptide for MSC homing in vivo. Biomaterials. 33 (12), 3375-3387 (2012).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30 (4), 583-588 (2009).
- Wise, S. G., et al. A multilayered synthetic human elastin/polycaprolactone hybrid vascular graft with tailored mechanical properties. Acta Biomater. 7 (1), 295-303 (2011).
- Vargel, I., Korkusuz, P., Menceloğlu, Y. Z., Pişkin, E. In vivo performance of antibiotic embedded electrospun PCL membranes for prevention of abdominal adhesions. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 81 (2), 530-543 (2007).
- Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction. J Biomed Mater Res A. 93 (3), 1151-1159 (2010).
- Joshi, V. S., Lei, N. Y., Walthers, C. M., Wu, B., Dunn, J. C. Macroporosity enhances vascularization of electrospun scaffolds. J Surg Res. 183 (1), 18-26 (2013).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Vaz, C. M., van Tuijl, S., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multi-layering electrospinning technique. Acta Biomater. 1 (5), 575-582 (2005).
- Kawamura, S., Ying, L., Kim, H. J., Dynybil, C., Rodeo, S. A. Macrophages accumulate in the early phase of tendon-bone healing. J Orthop Res. 23 (6), 1425-1432 (2005).
- Hays, P. L., et al. The role of macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel. J Bone Joint Surg Am. 90 (3), 565-579 (2008).
- Dagher, E., et al. Immobilization modulates macrophage accumulation in tendon-bone healing. Clin Orthop Relat Res. 467 (1), 281-287 (2009).
- Bedi, A., et al. Effect of early and delayed mechanical loading on tendon-to-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction. J Bone Joint Surg Am. 92 (14), 2387-2401 (2010).
- Bedi, A., Kawamura, S., Ying, L., Rodeo, S. A. Differences in tendon graft healing between the intra-articular and extra-articular ends of a bone tunnel. HSS J. 5 (1), 51-57 (2009).
- Fu, S. C., et al. Effect of graft tensioning on mechanical restoration in a rat model of anterior cruciate ligament reconstruction using free tendon graft. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 21 (5), 1226-1233 (2013).
- Fan, H., Liu, H., Wong, E. J., Toh, S. L., Goh, J. C. In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold. Biomaterials. 29 (23), 3324-3337 (2008).
- Landis, J. R., Koch, G. G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 33 (1), 159-174 (1977).
- Joshi, S. M., Mastrangelo, A. N., Magarian, E. M., Fleming, B. C., Murray, M. M. Collagen-platelet composite enhances biomechanical and histologic healing of the porcine anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 37 (12), 2401-2410 (2009).
- Leong, N. L., et al. In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate ligament reconstruction. J Orthop Res. 10, (2014).
- Seo, Y. K., et al. Increase in cell migration and angiogenesis in a composite silk scaffold for tissue-engineered ligaments. J Orthop Res. 27 (4), 495-503 (2009).
- Freeman, J. W., Woods, M. D., Laurencin, C. T. Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design. J Biomech. 40 (9), 2029-2036 (2007).
- Bashur, C. A., Shaffer, R. D., Dahlgren, L. A., Guelcher, S. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).
- Dash, T. K., Konkimalla, V. B. Poly-є-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).
- Xu, Y., Ao, Y. F. Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).
- Shino, K., et al. Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog. J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).
- Stasiak, M. E., et al. A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction. J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).
- Brophy, R. H., et al. Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model. J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).
