בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש Branchiomeric

Summary

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

Abstract

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

Introduction

על 1: 500 עד 1: 1000 תינוקות תערוכה שסועים מעורבים השפה ו / או חיך (CLP); כך זה מום המולד הנפוץ ביותר בבני האדם ^1. השרירים של החיך הרך הם קריטיים לתפקודו של החיך הרך בדיבור, בליעה, ומציצה. אם שסוע של החיך הרך הוא הווה, שרירים אלה מוכנסים באופן חריג לקצה האחורי של עצם החיך.

החיך הרך נע מעלה ומטה במהלך נאום, מניעת אוויר לברוח דרך האף. ילדים עם שסע בחיך אין לי פונקצית שליטה זו וכתוצאה מכך תופעה הידועה בתפקוד velopharyngeal ^2,3. למרות שפרוטוקולי הטיפול משתנים, התיקון ניתוחי של החיך הרך מתרחש בילדות המוקדמת (6-36 חודשים של גיל) ^4. השרירים מוכנסים באופן חריג של החיך הרך ניתן לתקן בניתוח ^5-7, לעומת זאת, תפקוד לקוי של velopharyngeal נמשך ב -7% עד 30%של החולים ^2,3,8-10.

יכולתו של שריר שלד להתחדש דרך הפעולה של תאי לווין (SCS) היא מבוססת היטב ^11,12. על פגיעה בשרירים, מאמנים מופעלים ולעבור לאתר של פציעה. לאחר מכן הם מתרבים, להבדיל, ולמזג ליצירת myofibers החדש או אלה תיקון פגום ^13. מאמנים רגיעה להביע גורם שעתוק Pax7 ^14,15, בעוד צאצאיהם, myoblasts מתרבים, גם להביע גורם myogenic נחישות 1 (Myod) ^16. myoblasts ההבחנה להתחיל להביע myogenin (MyoG) ^17. בידול המסוף של myoblasts מסומן על ידי ההיווצרות של myofibers, והביטוי של חלבוני שריר ספציפי כגון שרשרת שרירן כבדה (MyHC) ^16,18.

לאחרונה, מספר אסטרטגיות כבר בשימוש ברפואת רגנרטיבית לשפר התחדשות שריר של שרירי גפיים ^19-23. מחקרים ספציפיים עלשרירי ראש branchiomeric חשובים גם משום שהוא הוכיח לאחרונה כי הם שונים משרירים אחרים בכמה היבטים ^24. בניגוד לשרירי גפיים, זה כבר הציע שרירי ראש branchiomeric מכילים פחות SCS ^25, להתחדש איטי יותר, ורקמת חיבור סיבית יותר נוצר לאחר פציעת ²⁶ בנוסף, מתרבות מאמנים משרירי ראש branchiomeric גם להביע את גורמי שעתוק אחרים. לדוגמא, Tcf21, גורם שעתוק לבניית שריר craniofacial בחום לידי ביטוי בהתחדשות שרירי ראש אבל לא בהתחדשות שרירי גפיים ^25. השרירים בחיך הרך של חולי CLP הם בדרך כלל קטנים ומאורגן היטב פחות בהשוואה לשרירי חיך רגיל ^27,28. סיבים איטיים ומהירים גם נמצאים בשרירי החיך הרכים אבל הסיבים איטיים הם שופעים יותר. לעומת זאת, שרירים שסועים מכילים שיעור גבוה יותר של סיבים מהירים וגם אספקת נימים מופחתתלעומת שרירי חיך רכים נורמלים ^29-31. סיבים מהיר נוטים יותר לפגיעה הנגרמת על-התכווצות ^31-33. אספקת נימי עניים הנלווית עשויה גם לקדם סיסטיק ^34,35. כל ההיבטים הללו עשויים לתרום לעניי ההתחדשות של שרירי חיך רכים לאחר סגירה שסועה כירורגית ^36. לאור זאת, פרוטוקול לבידוד והאפיון של שריר ראש branchiomeric SCS הוא חיוני. זה מספק את האפשרות ללמוד ביולוגיה SC של שרירי ראש branchiomeric. בנוסף, ניתן לפתח טיפולים חדשים המבוססים על הנדסת רקמות לקידום התחדשות שריר לאחר הניתוח בCLP ותנאים אחרים להתפשר אזור craniofacial.

באופן כללי, ניתן לקבל SCS לאחר הניתוק של רקמת שריר ^14. ממינסינג, עיכול אנזימטי, וטחינה הדקה נדרשים בדרך כלל כדי לשחרר מאמנים מהנישה שלהם. יכול להיות מטוהר SCS ידי מראש ציפוי על מנות ללא ציפוי ^14,37,38, fractionation על Percoll ^39,40, תא או ניאון או מגנטי מיון ^41-43. כאן אנו מציגים פרוטוקול כלכלי ומהיר חדש לבידוד של תאי לווין משרירי ראש branchiomeric של חולדות מבוגרות צעירות. פרוטוקול זה מבוסס על כתב יד קודמת ¹⁴ ומותאם ספציפית לדגימות רקמה קטנות. הבידוד של מאמנים משרירי נציג מקורם ^-1, 2 ^nd, ו -4 קשתות branchial ^ה מתואר. לאחר בידוד, מספרים נמוכים של תאי לווין בתרבית על כתמי ג'ל מטריקס בגודל מילימטר ללמוד הבידול שלהם. גישה זו תמנע את הדרישה להרחבה וpassaging של מאמנים.

Protocol

כל הניסויים המתוארים במסמך זה אושרו על ידי הדירקטוריון המקומי לניסויים בבעלי חיים מRadboud ניימיכן האוניברסיטה בהתאם לחוקים ולתקנות (RU-DEC 2,013-205) הולנדיים. 1. כתמים תאי מטריקס ג'ל בצע את השלבים הבאים יום אחד לפני הבידוד: להפשיר ג'ל מטריקס aliquot (100 μl) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1.5 שעות. לדלל 1:10 ב הבינוני של הנשר שונה Dulbecco; עם 4,500 מ"ג / גלוקוז L, 4 המ"מ L- גלוטמין, ו -110 מ"ג / מיליליטר נתרן פירובט (DMEM). שמור את הג'ל מטריקס על 4 מעלות צלזיוס בכל העת. הערה: שינויי טמפרטורה פתאומיים יגרמו ציפוי אחיד והיווצרות גבישים. שמור את פתרון ג'ל מטריקס המדולל על קרח במשך 15 דקות. טרום צמרמורת micropipette 20 μl במשך 10 דקות. שים שקופיות קאמריות 8 היטב לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ ולהעביר את הצלחת על גבי משטח קר (לדוגמא חבילת מקפיא) למשך 10 דקות. השתמש micropipette מראש צונן לשים טיפה של ג'ל מטריקס 10 μl בכל טוב. שמור את צלחת פטרי על פני השטח הקרים לפחות עוד 7 דקות (איור 1 א). להסיר לחלוטין את הג'ל מטריקס הנותר (איור 1), ולייבש את הבארות על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. 2. שרירי Dissection של הראש (Masseter, Digastric, וLevator Veli Palatini) לפני הנתיחה, להכין 50 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS) בתוספת 2% פניצילין, סטרפטומיצין (P / S). שמור על קרח. לאחר המתת חסד של עכברוש אחד צעיר מבוגר (9 שבועות) עם CO 2 / O 2, לערוף את הראש ולהסיר את העור מהראש. העבר את הראש לPBS קר כקרח בתוספת 2% P / S בשפופרת 50 מיליליטר. שריר המלעס (הנגזר מקשת branchial 1) מניחים את הראש עם צד אחד עד על כרית סיליקון ולתקן עם n המזרקeedles (איור 2 א). זהה את בלוטת הפרוטיד ועצב פנים (איור 2 א). לחשוף את fascia העמוק מכסה את הבלוטה. חותך את fascia ולהסיר את הבלוטה באמצעות מספריים לנתיחה. זהה את תעלת השמע החיצונית. עקוב אחר עצב הפנים מנקב stylomastoid ולהסיר בזהירות את הסניפים זמניים, הזיגומטית, ולחי עם להב מס '15 אזמל. לשחרר את הראש השטחי של השריר המלעס ידי הסרת fascia. לזהות ראשי שני שטחיים ועמוקים של השריר המלעס. עקוב אחר הראש השטחי עד אָלָל tendinous העבה שלה הוכנס בתהליך הזיגומטית של הלסת העליונה. הפרד את הגיד ממקורו בתהליך הזיגומטית עם מלקחיים ישר. לחתוך אותו בסכין אזמל מס '15 או מספריים לנתיחה ובזהירות חיים זה (איור 2). לנתח את הראש השטחי של masseter עד כניסתה בזווית וחצי הנחותה של tהוא רוחב פני השטח של Ramus של הלסת התחתונה עם מס '15 להב סכין מנתחים (איור 2 ג). עכשיו, להסיר לחלוטין את השריר. בטן אחורית של שריר digastric (הנגזרת מקשת 2 nd branchial) מניחים את הראש במצב שכיבה על משטח סיליקון ולתקן עם מזרקים (איור 3 א). הסר את השומן תת עורי שמעל שני sublingual ובלוטות submandibular. בשלב הבא, להסיר את fascia ובלוטות באמצעות מספריים לנתיחה השטחיים. לחשוף את השרירים digastric (קדמית ואחורית בטן). החזק את הגיד הקדמי של הבטן האחורית עם מלקחיים ישר, לחתוך אותו, ולנתח אותו בזהירות עד שמקורו בבולת התוף (איור 3). לעשות את אותו הדבר בצד הנגדי. שריר Levator palatini Veli (הנגזר מקשת branchial 4) לאחר הנתיחה של הבטן האחורית של שריר digastric, למקם את השרירים stylohyoid, למשוך אותו לרוחב, ולהסיר אותו (איור 4 א) בזהירות. למקם את הגיד של palatini Veli Levator שמחדיר בבולת התוף (איור 4 א). לנתח את זה בזהירות ולחתוך אותו משני הצדדים. חפש את קנה הנשימה והוושט שפועל מאחוריו. הרם את הוושט, ולחשוף את הלוע, הגרון וחיך הרך. למקם את האזור של החיך הרך שבי palatini Veli Levator מוכנס ולחתוך אותו רופפים (איור 4). הערה: מייד לאחר נתיחה, להסיר בזהירות גיד ורקמות חיבור מכל שריר מתחת למיקרוסקופ סטריאו. לצלול כל הדגימות במהירות באתנול 70%, ולהעביר אותם לPBS קר כקרח בתוספת 2% P / S בשפופרת 15 מיליליטר. 3. בידוד של תאי לווין בצע את שלבי ההכנה הבאות לבידוד SC מ 3 קבוצות של שרירים: הכן 7.5 מיליליטר של pronase 0.1% בDMEM. סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. טרום חם הפתרון על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות לפני הבידוד. הכן 35 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% על סוסים סרום (HS) ו -1% P / S. טרום חם גם על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. הכן 15 מיליליטר מדיום התרבות אשר מורכב DMEM בתוספת 20% בסרום שור עוברי (FBS), 10% HS, 1% P / S ו 1% תמצית עובר עוף (CEE). טרום חם על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. שש טפטפות טרום מעיל פלסטיק (10 מיליליטר) עם HS ויבש במשך לפחות 10 דקות לפני השימוש. בשכונה התרבות, להעביר כל שריר לתוך באר של צלחת 6-היטב. שימוש במספריים לנתיחה, לחתוך את השריר בחתיכות קטנות של כ -2 מ"מ. היזהר שלא לקצץ את הרקמה יותר מדי. בזהירות להוסיף 2.5 מיליליטר של 0.1% פתרון pronase היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. נער בעדינות את הצלחת אחרי 20, 40, ו -60 דקות. הערה: duratio המדויקn של הדגירה תלויה בגורמים כמו גיל ומתח של בעלי החיים. צג מתחת למיקרוסקופ. בדוק את שברי השריר ולהפסיק את עיכול אנזימטי כאשר חבילות הסיבים לקבל מראה רפוי (איור 5). להוסיף 2.5 מיליליטר של DMEM בתוספת HS 10% ו -1% P / S. העבר לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות הצינורות ב 400 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant ידי decantation. הוסף 5 מיליליטר DMEM בתוספת HS 10% ו -1% P / S. פיפטה הפתרון למעלה ולמטה עם פיפטה 10 מיליליטר פלסטיק (טחינה דקה) לפחות 20 פעמים כדי homogenize הרקמה. בצנטריפוגה הצינורות ב XG 200 במשך 4 דקות. לאסוף את supernatant ולהעביר לתוך צינור 15 מיליליטר. הוסף 5 מיליליטר DMEM בתוספת HS 10% ו -1% P / S. פיפטה שוב עם טפטפת פלסטיק 10 מיליליטר עד שברי הרקמות עוברת בקלות דרך פיפטה. בצנטריפוגה הצינורות ב XG 200 במשך 4 דקות ולאסוף את supernatant בצינור 15 מיליליטר. Put מסננת תא (40 מיקרומטר) על צינור 50 מ"ל ולהעביר את supernatant המכיל את התאים ניתקו על המסנן. לשטוף עם DMEM 1 מיליליטר להתאוששות תא מקסימאלי. צנטריפוגה הצינורות XG ב 1000 עבור 10 דקות וזורקים supernatant עם pipet. Resuspend גלולה במדיום תרבות 300 μl ולספור את התאים בhemocytometer. 4. התמיינות של תאי לווין בכתמים תאי מטריקס ג'ל לדלל את ההשעיה התא להשיג 1.5 x 10 3 תאים ב 10 μl של מדיום התרבות. אבטח את הכיסויים של שקופיות תאים עם קלטת ולסמן את הנקודות עם טוש שחור בצד התחתון של זכוכית האובייקט. באמצעות micropipette, לשים טיפה של השעיה תא 10 μl על מקום ג'ל מטריקס. בדוק תחת מיקרוסקופ אם הירידה של השעיה תא הושמה כהלכה במקום. דגירה במשך שש שעות על 37 מעלות צלזיוס. זהירly להוסיף 400 μl של מדיום התרבות (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / S CEE ו -1%) ודגירה במשך שלושה ימים על 37 מעלות צלזיוס. הערה: בשלב זה, SC מבודד טרי חשופים לטראומה מסיבית (תקציר האנזימטית וטחינה דקה קשה) והם צריכים להתאושש. נא לא להפריע לתאים במהלך שלושת הימים הראשונים 37. בשלב הבא, מדיום התרבות יכול להיות שונה בהתאם לסוג של ניסוי. ניתן נזרעו כתמי מטריקס ג'ל עם צפיפות גבוהה של תאים (1.5-2.5 x 10 3/20 μl) עבור assay בידול. תרבות בינונית (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / S ו 1% תמצית עובר עוף) יכול להיות מוחלף בכל יום שלישי. לחלופין, אם הרחבה וחולפת היא רצויה לבצע את השלבים הבאים: להפשיר ג'ל מטריקס aliquot (500 μl) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1.5 שעות. לדלל 1:10 ב DMEM ולבצע את ההמלצות בנקודה 1.1.1. טרום צמרמורת פיפטה 10 מיליליטר במשך 10 דקות ב 4 ו# 176; ג. העבר את שלוש צלוחיות T75 על גבי משטח קר (לדוגמא חבילת מקפיא) למשך 10 דקות. השתמש פיפטה מראש צונן לשים 1 מיליליטר ג'ל מטריקס לכל בקבוק. בדוק שהשטח מכוסה לחלוטין. שמור את צלוחיות על פני השטח הקרים לפחות עוד 7 דקות (איור 1 א). להסיר לחלוטין את הג'ל מטריקס נותר עם פיפטה 10 מיליליטר, ולייבש את הבארות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לאחר הספירה, resuspend SCS המבודדים הטרי ב 10 מיליליטר של מדיום תרבות (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / S ו 1% תמצית עובר עוף) וזרע בצלוחיות T75 מצופה מראש. אחרי שלושה ימים, לשנות הבינוני (ובכל יום שלישי) עד מפגש 80% הוא הגיע. לpassaging, לשטוף את צלוחיות T75 שלוש פעמים עם PBS. הבא להוסיף 1 מיליליטר 0.25% פתרון טריפסין ודגירה של שלוש דקות על 37 מעלות צלזיוס. גלול ב9 מיליליטר של מדיום התרבות (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / Sו 1% תמצית עובר עוף) וצנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. בטל supernatant. לאחר הספירה, resuspend 1 x 10 6 תאים ב1,000 μl של מדיום התרבות ולהקפיא את התאים.

Representative Results

Using this protocol, the masseter muscle (one side) yields 0.8-1 x 106 cells, the digastric muscle (posterior belly) yields 1.5-2 x 105 cells, and levator veli palatini muscle yields 1-1.5 x 105 cells. Cell yields depend on the muscle type, strain, and age of the animal. For comparison between the three muscle groups, freshly isolated SCs were seeded at the same cell density (1.5 x 103/10 µl). Directly after isolation, more than 90% of the freshly isolated cells express Pax7 (Figure 6). Day 4, 7 and 10 cultures were stained with antibodies against Pax7, MyoD, MyoG and MyHC immunostaining. Five arbitrary fields were counted per culture using a 20X objective. At day 4 Pax 7 and Myo D is expressed in all muscle groups (Figures 6 and 7 and 8), however the progeny of SatCs from the masseter and digastric muscles start expressing myogenin earlier than the levator veli palatini muscle (Figure 9). At day 10, the expression of MyoG is strongly reduced in all groups (Figure 9). A few days after seeding on the extracellular matrix gel spots, the proliferating cells begin to fuse and form multi-nucleated myotubes, which express myosin heavy chain. Small myotubes are clearly visible at day 7 (Figure 10). At day 10, twitching of the myotubes can be observed (Video 1). Figure 1: Extracellular matrix gel spots in a chamber slide. (A) For easy manipulation, place the 8-well chamber slide into a 100 mm Petri dish. Pipet 10 µl extracellular matrix gel in each chamber and put it on a cold surface (7 min). (B) Chamber slide after the excess extracellular matrix gel is removed. Figure 2: Dissection of the masseter muscle. (A) Head of the animal in a lateral view. Ear (E), Parotid gland (P) and facial nerve (VII). (B) Tendinous aponeurosis (Te) of the superficial head of the masseter muscle (Ms) and temporal muscle (T). Separate the tendon from its insertion with a forceps. (C) Carefully dissect the muscle until its insertion at the ramus of the mandible. E: ear, P: parotid gland, VII: facial nerve, T: Temporal muscle, Ms: superficial head of the masseter muscle, Te: tendon, Mp: deep head of the masseter muscle. Figure 3: Dissection of the posterior belly of the digastric muscle. (A) Head of the animal in a supine position. Localize the submandibular gland (Sg), masseter muscle (M), facial nerve (VII) and sternocleidomastoid muscle (SCM). Remove the submandibular gland. (B) Localize the digastric muscle anterior (AD) and posterior belly (PD). With a straight forceps, take the anterior tendon of the posterior belly, cut it and dissect it carefully until its origin in the tympanic bulla (ty). E: ear, Sg: submandibular gland, VII: facial nerve, M: masseter muscle, SMC: sternocleidomastoid muscle, AD: anterior belly digastric muscle, PD: posterior belly digastric muscle, Ty: Tympanic bulla. Figure 4: Dissection of the levator veli palatini muscle. (A) General view after dissection of the digastric muscle (posterior belly). Stylohyoid muscle (St) and tendon of the levator veli palatini can be localized. Note the trachea (T) and esophagus (Es) running behind it. (B) After lifting the trachea and the esophagus the pharynx (P) is exposed. The levator veli palatini that runs laterally towards the soft palate is now visible. The arrow indicates the dissected superior pharyngeal constrictor muscle; note the levator veli palatini muscles at both sides. E: ear, St: stylohyoid muscle, VII: facial nerve, M: masseter muscle, AD: anterior belly digastric muscle, PD: posterior belly digastric muscle, T: trachea, Es: esophagus, P: Pharynx, *levator veli palatini muscle. Figure 5: Appearance of the muscle tissue (A) before and (B) after enzymatic digestion with pronase. Note that muscle bundles appear to be loosened after enzymatic digestion. Figure 6: Pax 7 immunostaining. Freshly isolated SCs, applied to extracellular matrix gel at the end of isolation (about 6 hours after initial tissue digestion). Five arbitrary fields were counted using a 10X objective with an average of 210 cells per field. Approximately 90% of the cells are Pax 7 positive. DAPI: blue, Pax7: red. Scale bar, 100 µm. Figure 7: Pax 7, MyoD immunostaining. Day 4, 7 and 10 cultures were stained with antibodies against Pax7, and MyoD immunostaining. (A–C) and (D–F) Representative photomicrographs of day 4 and 7 cultures from the masseter muscle. (G and H) The number of Pax7+ and MyoD+ nuclei per microscopic field was counted and expressed as a percentage of the total number of nuclei (DAPI). DAPI: blue, Pax7: red, and MyoD: green. Scales bar, 100 µm. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 8: Distribution of Pax7±/MyoD± in cultures from mononucleated cells in cultures from masseter, digastric and levator veli palatine muscle. (A–C) Day 4, 7 and 10 cultures were stained with antibodies against Pax7, and MyoD immunostaining. The total number of cells is based on of the total number of nuclei (DAPI). (D) Data quantification of Pax7±/MyoD± cells. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 9: Myogenin immunostaining. Day 4, 7 and 10 cultures were stained with antibodies against Myogenin. (A–D) Representative photomicrographs of day 4 and 7 cultures from the levator veli palatine muscle. (E) The number of MyoG+ nuclei per microscopic field was counted and expressed as a percentage of the total number of nuclei (DAPI). (F) Data quantification of MyoG+ cells. DAPI: blue, Myogenin: green. Scales bar, 100 µm. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 10: Myosin Heavy Chain immunostaining. Day 4, 7 and 10 cultures were stained with antibodies against myosin heavy chain (MyHC). Representative photomicrographs of day 4, 7 and 10 cultures from the digastric (DIG) muscle. At day 7, small myotubes are present while at day 10 long and well-organized myotubes are evident. Scales bar, 200 µm. Please click here to view a larger version of this figure. Video 1: Myotube twitching. Examples of two representative fields with twitching myotubes are shown for day 10 cultures from digastric muscle. Please click here to view this video.

Discussion

SCs from different branchiomeric head muscles were isolated from one 9-week-old Wistar rat and cultured directly on extracellular matrix gel spots without prior expansion and passaging. After isolation, the cells were counted and seeded at the same cell density. For the parallel isolation of three different muscles, this method takes about 4 hr. To avoid culture contamination, a critical step is the rapid washing in alcohol 70% after dissection of the muscles.

During SC isolation it is important to cut the muscle tissue into small pieces (about 2 mm) but avoid too much mincing as this will result in a small cell yield because of cell damage. Also, the duration of the enzymatic digestion must be checked carefully under the microscope to avoid further damage. The aim of the digestion is to dissociate the myofibers. Since more than 90% of the isolated cells express Pax7, no further purification is required (Figures 6-8). This avoids extra purification steps in other methods such as pre-plating on uncoated dishes^14,37,38, fractionation on Percoll^39,40, or fluorescent- or magnetic cell sorting^41,43. For trituration it is essential to induce shear between the tissue fragments and the opening of the pipette tip as this allows the mechanical release of the SCs. If the trituration with a 10 ml pipette (inside diameter tip: 1 mm) is difficult, a 5 ml (inside diameter tip: 2 mm) pipette can be used first. Alternatively, glass Pasteur pipettes can be cut at the desired diameter and be used. This method is simple, efficient and allows the simultaneous isolation of SC from different muscle samples.

The culture plates for SCs can also be coated with gelatin or collagen, but our previous studies show that extracellular matrix gel is far better for the maintenance of the myogenic potential than collagen³⁸. The extracellular matrix gel spots of millimeter size (10 µl/Ø 2 mm or 20 µl/Ø 4 mm) allows the study of proliferation and differentiation of SCs with limited numbers of cells. For the differentiation assay about 8 to 20 times fewer cells are required compared to a 24-well plate (Ø 15.6 mm), and about 80 to 200 times fewer compared to 35 mm Petri dishes (Ø 35 mm)^14,38.

Since extracellular matrix gel is expensive, this method is also more cost-efficient. In addition, the chamber slides can be replaced by plastic cover slips to further reduce the costs. For the preparation of the extracellular matrix gel spots overnight drying of the chamber slides is essential. As the extracellular matrix gel spots are transparent, it is necessary to mark the spots at the bottom side using back lighting. The chambers slides are fixed in a Petri dish for easy manipulation. Further cell culture expansion is not necessary, which offers the possibility to study the SCs of smaller muscles or small muscle samples. Alternatively, e.g. for PCR or muscle constructs if more cells are needed, the freshly isolated SCs can first be expanded in T75 flasks as indicated above.

SCs isolated using this protocol are not suitable for further purification with flow cytometry immediately after isolation. The digestion with pronase causes extensive digestion of the surface antigens¹⁴. Horse serum and fetal bovine serum that are used for cell culture must first be properly characterized before isolation, as different lot numbers differentially affected myoblasts proliferation and differentiation.

In recent years, there is a growing interest in the muscles derived from the branchial arches and the head mesoderm (e.g. the extraocular muscles)²⁴. It has been clearly demonstrated that head and limb muscles possess highly different properties. Masseter muscle from old animals seems to retain their regenerative capacity in comparison with limb muscles^25,26. SCs from the extraocular muscles possess a robust proliferation and differentiation capacity comparable to SCs from head muscles, and show a larger engraftment potential than limb muscle SCs²⁴.

The fiber type distribution and myosin composition varies among muscle groups and also between species. Muscles originating from the first branchial arch in humans contain both slow and fast fibers (subtypes IIA and IIX), neonatal myosins and myosins typical for developing cardiac muscle. In rodents these muscles contain about 95% fast fibers myosin IIA and IIb)^44-46. Studies on avian muscles show that SCs from different muscle fiber types vary in differentiation capacity. SCs from fast fibers only differentiate into fast muscle fibers, while SCs from slow fibers can differentiate into both fiber types⁴⁷. In addition, the percentage of SCs in fast muscle fibers is lower than in slow muscle fibers^48,49. This indicates that the fiber type distribution must be taken into account for studies on muscles in the craniofacial area. Similar to cleft palate muscles, the LVP in rodents contains almost exclusively fast fibers⁵⁰. For that reason, SCs from the LVP are suitable for pre-clinical studies in the field of cleft palate.

This protocol offers new possibilities to study SCs derived from branchiomeric head muscles or other smaller muscles or smaller muscles samples. This will facilitate the development of new therapies to improve the regeneration of muscles in the maxillofacial area in conditions such as cleft palate but also in other conditions affecting smaller muscles.

Materials

Hypodermic Needle 25G 0,5x25m	BD Microlance	300400
Dissecting scissors	Braun	BC154R
Micro forceps straight	Braun	BD330R
Surgical Scalpel Blade No.15	Swann-Morton	0205
Alcohol 70%	Denteck	2,010,005
Permanox Slide, 8 Chamber	Thermo Scientific	177445
6 well cell culture plate	Greiner bio-one	657160
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm)	Greiner bio-one	664160
15 ml sterile conical centrifuge tube	BD Biosciences	352097
50 ml sterile conical centrifuge tube	BD Biosciences	352098
Cell strainer (40 μm)	Gibco	431750
10 mL serological pipette	Greiner bio-one	607180
20µL FT20	Greiner bio-one	774288
Matrigel, Phenol-Red Free	BD Biosciences	356237	10 mL
Pronase	Calbiochem	53702	10KU
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	500 mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	10569-010	500 mL
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	3600511	500 mL
Horse Serum	Gibco	26050088	500 mL
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	100 mL
Chicken Embryo Extract	MP Biomedicals	2850145	20 mL