Detta protokoll beskriver isolering av satellitceller från branchiomeric huvudet musklerna i en 9 veckor gammal råtta. Musklerna har sitt ursprung från olika brankiala valv. Därefter satellitcellerna odlas på en plats beläggning av millimeterstorlek för att studera deras differentiering. Detta tillvägagångssätt undviker expansion och passage av satellitceller.
Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.
Om 1: 500 till 1: 1000 nyfödda uppvisar en klyfta omfattar läppen och / eller gomspalt (CLP); varför detta är den vanligaste medfödda missbildningar hos människor 1. Musklerna i mjuka gommen är kritiska för driften av den mjuka gommen under tal, svälja och suga. Om en kluven av den mjuka gommen är närvarande, är dessa muskler onormalt insatt i den bakre änden av den palatala benet.
Den mjuka gommen rör sig upp och ned under tal, vilket förhindrar luft att strömma ut genom näsan. Barn med en klyfta i gommen har inte denna kontrollfunktion som resulterar i ett fenomen som kallas velopharyngeal dysfunktion 2,3. Även om behandlingsprotokoll är rörlig, tar kirurgisk reparation av mjuka gommen plats i den tidiga barndomen (6-36 månader) 4. De onormalt insatta musklerna i mjuka gommen kan kirurgiskt korrigeras 5-7, dock kvarstår velopharyngeal dysfunktion hos 7% till 30%av patienterna 2,3,8-10.
Förmågan hos skelettmuskel att regenerera genom verkan av satellit celler (SCS) är väl etablerad 11,12. Vid muskelskada är SCS aktiveras och migrera till platsen för skadan. De sedan föröka sig, differentiera och smälta för att bilda nya myofibers eller reparera skadade de 13. Inaktiva SCS uttrycker transkriptionsfaktor Pax7 14,15, medan deras avkomma, de förökar myoblasts dessutom uttrycka myogenic bestämningsfaktor 1 (MyoD) 16. Skilja myoblaster börjar uttrycka myogenin (MyoG) 17. Den terminala differentieringen av myoblaster markeras genom bildning av myofibers, och uttrycket av muskelspecifika proteiner, såsom myosin tung kedja (MyHC) 16,18.
På senare tid har flera strategier använts i regenerativ medicin för att förbättra muskelregenerering av lem muskler 19-23. Specifika studierbranchiomeric huvudet muskler är också viktigt eftersom det var nyligen visat att de skiljer sig från andra muskler i flera avseenden 24. I motsats till lem muskler, har det föreslagits att branchiomeric huvudet muskler innehåller färre SCS 25, regenererar långsammare, och mer fibrös bindväv bildas efter skada 26 Dessutom prolifererande SC från branchiomeric huvudet muskler också uttrycka andra transkriptionsfaktorer. Till exempel är Tcf21, en transkriptionsfaktor för kraniofaciala muskelbildning uttrycks starkt i regenererande huvudet muskler men knappast i regenere lem muskler 25. Musklerna i mjuka gommen av CLP patienter är oftast mindre och mindre välorganiserade jämfört med normala palatinala muskler 27,28. Långsamma och snabba fibrer båda är närvarande i den mjuka gommen muskler men de långsamma fibrerna är mer riklig. Däremot kluven muskler innehålla en högre andel snabba fibrer och även en minskad kapillär tillförseljämfört med normala mjuka gommen muskler 29-31. Snabba fibrer är mer benägna att kontraktion-inducerade skador 31-33. Den medföljande dålig kapillär utbudet kan också främja fibros 34,35. Alla dessa aspekter kan bidra till de fattiga förnyelse av mjuka gommen muskler efter kirurgisk kluven stängning 36. Mot bakgrund av detta är av avgörande betydelse ett protokoll för isolering och karaktärisering av branchiomeric huvudet muskler kaster. Detta ger möjlighet att studera SC biologi branchiomeric huvudet muskler. Dessutom kan nya behandlingsmetoder baserade på vävnadsteknik utvecklas för att främja muskel återhämtning efter kirurgi i CLP och andra villkor komprometterande den kraniofaciala området.
I allmänhet kan SCS erhållas efter dissociation av muskelvävnad 14. Malning, enzymatisk uppslutning, och rivning i allmänhet krävs för att frigöra kaster från sin nisch. SC kan renas genom pre-plating på obelagda rätter 14,37,38, fractionation på Percoll 39,40, eller fluorescent- eller magnetisk cellsortering 41-43. Här presenterar vi en ny ekonomisk och snabb protokoll för isolering av satellitceller från branchiomeric huvudet musklerna i unga vuxna råttor. Detta protokoll är baserad på en tidigare manuskript 14 och speciellt anpassad för små vävnadsprover. Isoleringen av kaster från representativa muskler härrör från den 1: a, 2: a och 4: e brankiala valv beskrivs. Efter isolering, lågt antal satellitceller odlas på extracellulära matris gel fläckar av millimeterstorlek för att studera deras differentiering. Detta tillvägagångssätt undviker kravet på expansion och passage av kaster.
SC från olika branchiomeric huvudet muskler isolerades från en 9 veckor gammal Wistar-råtta och odlades direkt på extracellulär matrix gel fläckar utan föregående expansion och passaging. Efter isolering räknades cellerna och såddes vid samma celltäthet. För den parallella isolering av tre olika muskler, tar denna metod ca 4 h. För att undvika kontaminering kultur, är ett kritiskt steg i snabb tvättning i alkohol 70% efter dissektion av musklerna.
Under SC isolering är det viktigt att skära muskelvävnaden i små bitar (ca 2 mm) men undvika för mycket mals eftersom detta kommer att resultera i en liten cellutbyte på grund av cellskada. Dessutom måste varaktigheten av den enzymatiska digere kontrolleras noggrant under mikroskop för att undvika ytterligare skador. Syftet med matsmältning är att dissociera myofibers. Eftersom mer än 90% av de isolerade cellerna uttrycker Pax7, behövs ingen ytterligare rening behövs (figurerna 6-8).Detta undviker extra reningssteg i andra metoder såsom pre-plating på obelagda rätter 14,37,38, fraktionering på Percoll 39,40, eller fluorescent- eller magnetisk cellsortering 41,43. För finfördelning är det viktigt att inducera skjuvning mellan vävnadsfragment och öppnandet av pipettspetsen eftersom detta tillåter den mekaniska frikopplingen av kaster. Om finfördelning med en 10 ml pipett (innerdiameter tips: 1 mm) är svårt, en 5 ml (innerdiameter spets: 2 mm) kan pipett användas först. Alternativt kan glas Pasteur pipetter skäras vid önskad diameter och användas. Denna metod är enkel, effektiv och tillåter samtidig isolering av SC från olika muskelprover.
Odlingsplattorna för SCS kan också beläggas med gelatin eller kollagen, men våra tidigare studier visar att extracellulär matris gel är mycket bättre för underhåll av den myogena potential än kollagen 38. De extracellulära matris gel fläckar avmillimeterstorlek (10 | j, l / O 2 mm eller 20 | j, l / O 4 mm) möjliggör studiet av proliferation och differentiering av SCS med begränsade mängder celler. För differentiering analysen omkring 8 till 20 gånger färre celler erfordras jämfört med en 24-brunnsplatta (Ø 15,6 mm), och ca 80 till 200 gånger färre jämfört med 35 mm Petri-skålar (ø 35 mm) 14,38.
Eftersom extracellulär matrisgel är dyrt, är denna metod också mer kostnadseffektiva. Dessutom kan de kammare diabilder ersättas av plasttäckglas för att ytterligare minska kostnaderna. För framställning av den extracellulära matrisen gelén fläckar torkning över natten av kammarobjektglasen är viktigt. Eftersom den extracellulära matrisen gel fläckar är transparenta, är det nödvändigt att märka de fläckar vid bottensidan med hjälp av bakgrundsbelysning. Kamrarna glasen fixeras i en petriskål för enkel hantering. Ytterligare expansion cellodling är inte nödvändigt, vilket ger möjlighet att studera kaster av smalLer muskler eller små muskelprover. Alternativt, t.ex. PCR eller muskel konstruktioner om fler celler behövs, kan de nyisolerade kaster först utökas i T75-kolvar som anges ovan.
SC isoleras med hjälp av detta protokoll är inte lämpliga för ytterligare rening med flödescytometri omedelbart efter isolering. Uppslutningen med pronas orsakar omfattande nedbrytning av ytan antigener 14. Hästserum och fetalt bovinserum som används för cellodling måste först vara ordentligt karakteriseras före isolering, såsom olika partinummer differentiellt påverkas myoblaster proliferation och differentiering.
Under de senaste åren, finns det ett växande intresse för musklerna som härrör från brankiala valv och huvudet mesoderm (t.ex. de extraokulära muskler) 24. Det har tydligt visat att huvud och lem muskler har mycket olika egenskaper. Tuggmuskel från gamla djur tycks återTain deras förnyelseförmåga i jämförelse med lem muskler 25,26. SC från extraokulära muskler har en robust tillväxt och differentiering kapacitet jämförbar med kaster från huvudet muskler, och visar en större inympning potential än lem muskel SCS 24.
Fördelningen och myosin fibertyp sammansättning varierar mellan muskelgrupper och även mellan olika arter. Muskler som härrör från den första brankiala bågen hos människa innehåller både långsamma och snabba fibrer (subtyper IIA och IIx), neonatal myosiner och myosiner typiska för att utveckla hjärtmuskeln. Hos gnagare dessa muskler innehåller ca 95% snabba fibrer myosin IIA och IIb) 44-46. Studier på fågel muskler visar att kaster från olika muskelfibertyper varierar i differentieringskapacitet. SC från snabba fibrer bara differentiera till snabba muskelfibrer, medan kaster från långsamma fibrer kan differentiera till både fibertyper 47. Dessutom har andelen SC i snabb muskelfibrer är lägre än i långsam muskelfibrerna 48,49. Detta tyder på att fördelningen fibertypen måste tas hänsyn till studier på muskler i kraniofacial området. I likhet med gomspalt muskler, det bilproduktionen i gnagare innehåller nästan uteslutande snabba fibrer 50. Av den anledningen, kaster från LVP är lämpliga för prekliniska studier inom gomspalt.
Detta protokoll ger nya möjligheter att studera kaster härrör från branchiomeric huvudet muskler eller andra mindre muskler eller mindre muskler prover. Detta kommer att underlätta utvecklingen av nya behandlingsmetoder för att förbättra regenerering av muskler i maxillofacial område under förhållanden som gomspalt, utan även i andra förhållanden som påverkar mindre muskler.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).
Hypodermic Needle 25G 0,5x25m | BD Microlance | 300400 | |
Dissecting scissors | Braun | BC154R | |
Micro forceps straight | Braun | BD330R | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton | 0205 | |
Alcohol 70% | Denteck | 2,010,005 | |
Permanox Slide, 8 Chamber | Thermo Scientific | 177445 | |
6 well cell culture plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) | Greiner bio-one | 664160 | |
15 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352097 | |
50 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |
Cell strainer (40 μm) | Gibco | 431750 | |
10 mL serological pipette | Greiner bio-one | 607180 | |
20µL FT20 | Greiner bio-one | 774288 | |
Matrigel, Phenol-Red Free | BD Biosciences | 356237 | 10 mL |
Pronase | Calbiochem | 53702 | 10KU |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569-010 | 500 mL |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 3600511 | 500 mL |
Horse Serum | Gibco | 26050088 | 500 mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
Chicken Embryo Extract | MP Biomedicals | 2850145 | 20 mL |