सेल पारगम्य Cys का प्रयोग स्तनधारी कोशिकाओं को सीधे प्रोटीन डिलिवरी<sub> 2</sub> -His<sub> 2</sub> जिंक उंगली डोमेन
Summary
जिंक उंगली डोमेन के आंतरिक रूप से सेल पारगम्य और स्तनधारी सेल प्रकार की एक विस्तृत रेंज में प्रोटीन वितरण मध्यस्थता करने में सक्षम हैं। इधर, intracellular प्रोटीन प्रसव के लिए जिंक उंगली प्रौद्योगिकी को लागू करने के लिए एक विस्तृत कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है।
Abstract
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Introduction
अत्यधिक कुशल और बहुमुखी प्रोटीन वितरण रणनीतियों कई बुनियादी अनुसंधान और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं। कोशिकाओं में शुद्ध प्रोटीन के प्रत्यक्ष वितरण इस को प्राप्त करने के लिए सबसे सुरक्षित और आसान तरीकों में से एक। 1,2 न्यूक्लिक एसिड से जीन अभिव्यक्ति पर भरोसा रणनीति है कि विपरीत का प्रतिनिधित्व करता है, 3-5 प्रोटीन वितरण insertional उत्परिवर्तजनन का कोई खतरा बना हुआ है, से स्वतंत्र है सेलुलर प्रतिलेखन / अनुवाद मशीनरी और एक तत्काल प्रभाव के लिए अनुमति देता है। हालांकि, प्रोटीन पर सेल मर्मज्ञ गतिविधि endowing के लिए सरल और generalizable के तरीकों की कमी के कारण नियमित रूप से कोशिकाओं में उनके सीधे प्रवेश घालमेल कर दिया। इंट्रासेल्युलर प्रोटीन प्रसव की सुविधा के लिए मौजूदा तरीकों को स्वाभाविक रूप से 6-8 या डिजाइन सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स, 9-12 सुपरचार्ज पारगमन डोमेन, 13,14 नैनोकणों 15 और liposomes, 16 वायरस कणों की तरह 17,18 होने वाली के उपयोग पर आधारित हैं </समर्थन> और polymeric माइक्रोस्फीयर सामग्री। 19 दुर्भाग्य से, इन तरीकों में से बहुत कम सेलुलर तेज दरें, 20,21 गरीब स्थिरता, 22 अनजाने सेल प्रकार विशिष्टता, 23 कम endosomal भागने गुणों 24 और इसके अलावा विषाक्तता। 25 के द्वारा बाधा उत्पन्न कर रहे हैं, कई प्रोटीन पारगमन प्रौद्योगिकियों वितरित प्रोटीन की bioactivity कम। 14
हमारी प्रयोगशाला में पहले कि जस्ता उंगली nuclease का प्रदर्शन (ZFN) प्रोटीन – चिमेरिक प्रतिबंध एक प्रोग्राम Cys दो -His दो जस्ता उंगली डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन और FokI प्रतिबंध endonuclease 26-28 की दरार डोमेन से मिलकर endonucleases – स्वाभाविक सेल कर रहे हैं पारगम्य। 29 यह आश्चर्य की बात सेल मर्मज्ञ गतिविधि कस्टम डिजाइन जस्ता उंगली डोमेन, लक्षित जीनोम एन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है कि एक डीएनए बाध्यकारी मंच का अभिन्न संपत्ति होना दिखाया गया थाgineering, 30-32 और माना प्रोटीन सतह पर छह सकारात्मक आरोप लगाया अवशेषों के नक्षत्र का नतीजा हो। दरअसल, सी-जून और एन-Dek सहित कई डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन,। कोशिका झिल्ली को पार करने के लिए एक सहज क्षमता के अधिकारी दिखाया गया है 33 हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला इन परिणामों पर विस्तार किया है और दिखा दिया कि zinc- की सेल-मर्मज्ञ गतिविधि उंगली (ZIF) डोमेन इंट्रासेल्युलर प्रोटीन प्रसव के लिए leveraged किया जा सकता है। कई पारंपरिक सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड वितरण प्रणाली को पार कर कि क्षमता तेज करने के लिए नेतृत्व विशिष्ट प्रोटीन कार्गो के लिए एक या दो उंगली ZIF डोमेन के लिए या तो जेनेटिक संलयन। 34 सबसे विशेष रूप से, ZIF की मध्यस्थता वितरण इनकार एंजाइमी कार्गो की गतिविधि समझौता और मदद की नहीं था साइटोसोलिक प्रसव के उच्च स्तरों। सामूहिक रूप से, इन निष्कर्षों प्रोटीन के कुशल और सतही प्रसव की सुविधा के लिए ZIF डोमेन के संभावित प्रदर्शन, और मैक्रो का संभवत: अधिक विविध प्रकारकोशिकाओं में अणुओं।
इधर, स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन प्रसव के लिए ZIF प्रौद्योगिकी को लागू करने पर एक विस्तृत कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। हम पहले के एक कमरे का निर्माण एक, दो, तीन, चार, पांच और छह उंगली कारण α-पेचदार डीएनए बाध्यकारी अवशेषों में से प्रत्येक के प्रतिस्थापन के लिए, डीएनए बाध्य करने के लिए क्षमता की कमी है कि ZIF डोमेन, लेकिन कोशिकाओं 34 (चित्रा 1) में प्रोटीन देने में सक्षम हैं। एक दो उंगली ZIF डोमेन का उपयोग कर हेला कोशिकाओं में पन्ना GFP (EmGFP) के उत्पादन और पारगमन में वर्णित है। इस प्रोटोकॉल Escherichia कोलाई में घुलनशील अभिव्यक्ति और लगभग किसी भी स्तनधारी सेल प्रकार में सक्षम लगभग किसी भी प्रोटीन के लिए एक्स्टेंसिबल है। अपेक्षित परिणाम प्रदान की जाती हैं और इस प्रणाली के प्रदर्शन को अधिकतम करने के लिए रणनीतियों पर भी चर्चा कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इधर, सेल पारगम्य जस्ता उंगली (ZIF) डोमेन का उपयोग प्रोटीन वितरण के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। ZIF डोमेन इनकार एंजाइमी कार्गो 34 की गतिविधि को कम नहीं करता है; उत्पादन और असंशोधित प्रोटी…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम और ShanghaiTech विश्वविद्यालय, शंघाई, चीन (DP1CA174426 कार्लोस एफ Barbas करने के लिए) (जीएल करने के लिए) के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। आण्विक ग्राफिक्स PyMol का उपयोग कर उत्पन्न किया गया।
Materials
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
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