Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys<sub> 2</sub> -Il suo<sub> 2</sub> domini zinc-finger
Summary
Domini zinco-dita sono intrinsecamente cellula-permeabile e capace di mediare consegna proteine in una vasta gamma di tipi di cellule di mammifero. Qui, un protocollo dettagliato passo-passo per l'attuazione tecnologia zinc finger-consegna proteina intracellulare è presentato.
Abstract
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Introduction
Altamente strategie consegna proteine efficienti e versatili sono fondamentali per molti la ricerca di base e applicazioni terapeutiche. La consegna diretta di proteine purificate in cellule rappresenta uno dei metodi più sicuri e più semplici per raggiungere questo. 1,2 differenza strategie che si basano su espressione genica da acidi nucleici, proteine 3-5 consegna non comporta alcun rischio di mutagenesi inserzionale, è indipendente dal cellular trascrizione macchinari e / definizione permette un effetto immediato. Tuttavia, la mancanza di metodi semplici e generalizzabili per dotare l'attività delle cellule-penetrante su proteine confonde regolarmente il loro ingresso diretto nelle cellule. Gli attuali metodi per facilitare la consegna proteina intracellulare si basano sull'uso di naturalmente 6-8 o progettati peptidi cellula-penetranti, 9-12 domini di trasduzione sovralimentati, 13,14 nanoparticelle 15 e liposomi, 16 particelle simili al virus 17,18 </sup> materiali polimerici microsfere. 19 Purtroppo, molti di questi approcci sono ostacolati da bassi tassi di assorbimento cellulare, 20,21 scarsa stabilità, 22 involontaria tipo cellulare specificità, 23 basso endosomali proprietà di fuga di 24 e la tossicità. 25 Inoltre, molti proteine e tecnologie di trasduzione riducono la bioattività delle proteine consegnati. 14
Il nostro laboratorio in precedenza dimostrato che zinc-finger nucleasi (ZFN) proteine - restrizione endonucleasi chimerico costituito da una Cys 2 -Il suo 2 zinc-finger proteina-DNA-binding programmabile e il dominio scissione del FokI endonucleasi di restrizione 26-28 – sono intrinsecamente cell- permeabile. 29 L'attività delle cellule-penetrante sorprendente ha dimostrato di essere una proprietà intrinseca del dominio zinc-finger design personalizzato, una piattaforma di legame al DNA che è emersa come un potente strumento per la mirata del genoma enEngineering, 30-32 e considerato il risultato della costellazione di sei residui carichi positivamente sulla superficie della proteina. Infatti, diverse proteine che legano il DNA, tra cui c-Jun e N-DEK hanno dimostrato di possedere una capacità innata di attraversare le membrane cellulari. 33 Più recentemente, il nostro laboratorio espanso su questi risultati e dimostrato che l'attività delle cellule-penetrante di zinco finger (ZIF) domini potrebbero essere sfruttate per la consegna delle proteine intracellulari. La fusione genetica di entrambi i domini ZIF uno o due dita per uno specifico carico di proteine portato ad assorbimento di efficienza che hanno superato molti sistemi di consegna di peptidi cellula-penetranti convenzionali. 34 In particolare, la consegna Zif-mediata non ha compromesso l'attività di carico enzimatica fuso e facilitato alti livelli di consegna citosolico. Collettivamente, questi risultati dimostrano il potenziale del dominio ZIF per facilitare la consegna efficiente e facile delle proteine, e potenzialmente più diversi tipi di macromolecole, nelle cellule.
Qui, un protocollo dettagliato passo-passo su come implementare la tecnologia ZIF per la consegna delle proteine in cellule di mammifero è presentato. Abbiamo già costruito una suite di uno, due, tre, quattro, cinque e sei dita domini ZIF che non hanno la capacità di legare il DNA, a causa della sostituzione di ciascuno dei DNA-binding residui α-elica, ma sono in grado di fornire proteine in cellule 34 (Figura 1). La produzione e la trasduzione di Emerald GFP (EmGFP) in cellule HeLa utilizzando una Zif dominio a due dita è descritto. Questo protocollo è estensibile a quasi qualsiasi proteina in grado di espressione solubile in Escherichia coli e quasi ogni tipo di cellula di mammifero. I risultati attesi sono forniti e strategie per massimizzare le prestazioni di questo sistema vengono anche discussi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, un protocollo di step-by-step per la consegna delle proteine usando zinc-finger (ZIF) domini cellulari permeabili è presentato. Il dominio ZIF non riduce l'attività del fuso carico enzimatica 34; consente la produzione e purificazione di proteine dei rendimenti quasi identici a quelli osservati con proteine non modificato; e può trasportare proteine ed enzimi in una vasta gamma di tipi di cellule con efficienze superiori peptide o proteina sistemi tradizionali dominio trasd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (DP1CA174426 di Carlos F. Barbas) e ShanghaiTech University di Shanghai, in Cina (a JL). Grafici molecolari sono stati generati utilizzando PyMol.
Materials
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
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