Immagini dal vivo del ependimale Cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo
Summary
Utilizzando ad alta risoluzione di contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopia, un ex vivo osservazione del battito di ciglia motile ependimale situato all'interno il mouse ventricoli cerebrali è dimostrata dal live-imaging. La tecnica consente una registrazione della frequenza battito ciliare unico e battendo angolo come pure i loro calcio intracellulare proprietà oscillazione stimolazione.
Abstract
Cellule ependimali Multiciliated linea i ventricoli del cervello adulto. Funzione o la struttura di ciglia ependimali anormale è associata con vari deficit neurologici. L'attuale ex vivo imaging dal vivo di motilità tecnica cilia ependimale consente per uno studio dettagliato delle dinamiche ciliari dopo diversi passaggi. Questi passaggi sono: topi eutanasia con anidride carbonica secondo i protocolli della University of Institutional cura di Toledo degli animali e del Comitato uso (IACUC); craniectomy seguita dalla rimozione del cervello e sagittale dissezione del cervello con un vibratomo o lama affilata di ottenere sezioni molto sottili attraverso i ventricoli laterali del cervello, dove le ciglia ependimale possono essere visualizzati. L'incubazione delle fette del cervello in una lastra di vetro-bottom personalizzata contenente Modified Eagle Medium (DMEM) / High-Glucosio Dulbecco a 37 ° C in presenza di 95% / 5% O 2 / CO miscela 2 è essenziale per mantenere vivo il tessuto durantel'esperimento. Un video del pestaggio cilia viene registrato utilizzando un microscopio a contrasto di interferenza differenziale ad alta risoluzione. Il video viene poi analizzato fotogramma per fotogramma per calcolare la frequenza ciliare pestaggio. Questo permette la classificazione distinta delle cellule ependimali in tre categorie o tipi in base alla loro frequenza di battito ciliare e l'angolo. Inoltre, questa tecnica permette l'uso dell'analisi fluorescenza ad alta velocità per caratterizzare le proprietà uniche intracellulari oscillazione calcio di cellule ependimali, nonché l'effetto di agenti farmacologici sulle oscillazioni di calcio e la frequenza di battito ciliare. Inoltre, questa tecnica è adatto per immunofluorescenza di imaging per studi di struttura ciliare e localizzazione della proteina ciliare. Ciò è particolarmente importante in studi diagnosi della malattia e fenotipo. Il limite principale di questa tecnica è attribuita alla diminuzione in vivo movimento cilia motilità come il tessuto cerebrale inizia a morire.
Introduction
Cilia sono organelli basato microtubuli sensoriali che si estendono dalla superficie cellulare per l'ambiente extracellulare. A seconda della loro organizzazione dei microtubuli, ciglia possono essere classificati in due tipi – "9 + 0" o "9 + 2". Funzionalmente, sulla base della loro motilità, questi possono essere classificati come motile o non mobili cilia 1. Cilia primaria è un termine comunemente usato per indicare "9 + 0" cilia non mobili. Questi hanno nove microtubuli doppietto parallele (indicati con '9') e una coppia centrale di microtubuli è presenta all'interno della guaina centrale (indicato con '0'). Tuttavia, alcuni "9 + 0" cilia, come cilia nodale, che regolano embrione lateralità sono mobili 2. D'altra parte, cilia motile sono caratterizzati, oltre alle nove doppietti microtubuli parallele, da una coppia centrale supplementare di doppietti microtubuli e associata con proteine motrici dynein per facilitare la motilità. Inoltre, alcuni "9+2 "Cilia come ciglia olfattive sono non mobili 3. Cellule ependimali rivestono i ventricoli cerebrali e il canale centrale del midollo spinale sono caratterizzati da cilia motile che spingono il liquido cerebrospinale (CSF) lungo i ventricoli cerebrali 4.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di facilitare lo studio della motilità dinamiche ciglia e anomalie strutturali. Salute e lo sviluppo del cervello dipendono fortemente efficiente circolazione del liquor nei ventricoli cerebrali. Ad esempio, il normale flusso di CSF e l'equilibrio dei fluidi richiedono battito normale e funzionale delle ciglia ependimali 5,6, che a sua volta gioca un ruolo critico nella regolazione del movimento direzionale delle cellule neuronali e la migrazione delle cellule staminali 7. Come tale, anormale funzione cilia ependimali o la struttura può portare a flusso CSF anormali, che è associato con idrocefalo, una condizione medica in cui vi è un accumulo anomalo di CSF nei ventricoli del bpioggia. Ciò può di conseguenza causare un aumento della pressione intracranica e progressivo ampliamento della testa, convulsioni, visione a tunnel, e disabilità mentale 8.
I vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che ha permesso per la prima volta a segnalare tre distinti tipi di cellule ependimali: I, II, e III, sulla base della loro frequenza battito ciliare unica e l'angolo battendo. Queste cellule ependimali sono localizzati in alcune regioni nei ventricoli cerebrali. Inoltre, gli effetti dell'età e agenti farmacologici come alcol e cilostazolo sulla modifica i tipi di cellule ependimali o loro localizzazioni possono essere dimostrati, che non era possibile prima questa classificazione delle cellule ependimali. Cilostazolo è un inibitore della fosfodiesterasi-3, un enzima che metabolizza cAMP di AMP e regola anche il calcio intracellulare 9. Usando l'analisi di imaging di fluorescenza ad alta velocità permette l'imaging e la quantificazione del intracellulare unicoproprietà di oscillazione di calcio delle cellule ependimali. Ad esempio, alcol e cilostazol alterato significativamente la frequenza ciliare pestaggio ependimale nonché le oscillazioni intracellulari di calcio proprietà, che a sua volta, potrebbe portare a un cambiamento del volume del liquido cerebrospinale di sostituzione da ciglia ependimali 10. In sintesi, questa tecnica è stato fondamentale per fornire la prima prova di tre diversi tipi di cellule ependimali con diverse proprietà di oscillazione calcio.
Nella sezione seguente, una panoramica dettagliata passo-passo della procedura è prevista, prestando molta attenzione alla preparazione e la manipolazione dei tessuti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descritto è un protocollo per la preparazione di tessuto cerebrale topo sia per live-imaging e microscopia a fluorescenza che fornisce un rapido e sensibile osservazione delle ciglia ependimali nei ventricoli cerebrali. Questa tecnica non è limitato solo al ventricolo laterale; potrebbe essere utilizzata per osservare le ciglia in altre ventricoli cerebrali. Questa tecnica di imaging fornisce un flusso dal vivo che assomiglia al movimento del CSF battito ciliare in un ambiente ex vivo. Inoltre, essa conse…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
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