クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング
Summary
This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.
Abstract
Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.
Introduction
抗生物質の発見は20 世紀の最も偉大な科学的成果の一つでした。しかし、抗生物質の使用や乱用は、抗生物質耐性菌の急速な進化につながっている、これらは現在、21世紀の公衆衛生に深刻な脅威をもたらします。ほとんどの治療の選択肢に耐性細菌株の上昇は、我々は抗菌薬がもはや1,2に効果的である時代に入っている可能性を高めます。
抗生物質耐性を付与する遺伝子機構は年間3百万のすることによって、ヒトおよび抗生物質選択圧をより以前、古代のシステムです。このようなプラスミド、トランスポゾン、ゲノムの島々 、統合的な接合要素とインテグロンなどのモバイル遺伝的要素は、内および細菌種4との間の両方の抗生物質耐性遺伝子（ARG）を広めることができます。これらのうち、インテグロンはもかかわらず、ARGの普及において中心的な役割を果たしてきました彼らは細菌ゲノム5への動員および挿入するためのプラスミドおよびトランスポゾンに依存しているという事実。インテグロンはインテグロンインテグラーゼを用いた遺伝子カセットをキャプチャして、[エンコードされインテグロンプロモーター6,7（ 図1）を使用して、カセットを発現します。 インテグロン遺伝子カセットは、その製品の抗生物質や消毒剤8に対する抵抗性を付与することができる単一のオープンリーディングフレーム（ORF）からなる小型のモバイル要素です。クラス1インテグロンは、最も一般的に、それらをまとめて130の異なる抗生物質耐性遺伝子カセット9を介して取得した臨床分離株5から回収インテグロンです。
人間関連共生や病原性細菌へのクラス1インテグロンの広がりは、これらの遺伝子エレメント10の多くが含まれている人間の廃棄物の流れを生成します。クラス1インテグロンが含まれている推定10 19細菌が毎年下水汚泥を経てリリースされた私nはイギリス11。これは、抗生物質耐性を付与するクラス1インテグロンは今野生の鳥類、魚類、および他の野生生物の12-14の微生物叢中に検出されていることは驚くべきことではありません。新しい遺伝子カセットなどのモバイル要素と複雑な再配列の取得は、特に下水処理場や他の水域15-18で、引き続き発生するので、戻って環境にインテグロンを解放すると、重大な公衆衛生上の脅威をもたらします。自然環境は、新しい耐性決定と日和見病原体19,20のための肥沃な募集の地面になります。新規インテグロン含有細菌や新しいargsが汚染された水や食物21,22を通じて人間社会に戻って一周することができます。環境ARGSのサーベイランスは、理解と将来23に抗生物質耐性を管理するための重要な戦略です。具体的には、注意が生で食べたりしている食品に支払われるべきですこれらは、新しいモバイル要素と病原体の伝播のための最大の脅威を提示するので軽く、調理。
食品中のクラス1インテグロンおよびそれらに関連する遺伝子カセットが概説されて、検出、同定および特徴づけるためのこのプロトコルでは、効率的なアプローチ（ 図2）。培養およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の組み合わせを使用して、インテグロンは急速に複雑な細菌群集及び個々の分離株で検出することができます。細菌およびインテグロン関連遺伝子カセットの立体構造と同一の種を同定するための方法が挙げられます。この方法は、植物及び動物の食品の広い範囲に適しており、典型的なワークフローの例は、これらの食品の種類ごとに与えられています。
Protocol
Representative Results
Discussion
インテグロンおよびそれらに関連する遺伝子カセットの同定は、潜在的に、新たな日和見病原体の出現を予測する人間の食物連鎖の中に病原体のための経路を追跡し、新たな耐性を特定する際に重要なステップであり、毒性は8,21,26を決定因子。本稿の目的は、そのカセットの配列を特徴付けるし、それらが存在する細菌種を識別し、クラス1インテグロンのためのサンプルをスクリー…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ミカエラ·ホール、ラリッサビスポおよび技術支援のためのグスタボ·タバレスに感謝します。
Materials
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Used in all PCRs |
| RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) | Sigma | R6513-10MG | Used in all PCRs |
| HinFI restriction enzyme | Promega | R6201 | Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA |
| 100 bp ladder | GE Healthcare | 27400701 | Used as a size standard on all agarose gels |
| GelRed DNA stain | Biotium | 41003 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| Guanidinium Thiocyanate | Life Technologies | AM9422 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| CLS-TC Solution | MP Biomedicals | 6540409 | Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction |
| Lysing Matrix E FastPrep tubes | MP Biomedicals | 116914500 | Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available. |
| binding matrix | MP Biomedicals | 116540408 | Diluted 1:5 with 6M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method. |
| Fast Prep machine | MP Biomedicals | Number of options available | MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information |
References
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
- Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
- Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
- Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
- Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
- Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
- Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
- Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
- Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
- Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
- Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
- Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
- Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
- Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
- Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
- Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
- Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
- Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
- Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
- Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
- Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what’s new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
- Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
- Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
- Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
- Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
- Lane, D. J. . Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , 115-175 (1991).
- Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).
