Screening Livsmedel för klass 1 integroner och genkassetterna
Summary
This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.
Abstract
Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.
Introduction
Upptäckten av antibiotika var en av de största vetenskapliga resultaten av 20-talet. Emellertid har bruk och missbruk av antibiotika har lett till den snabba utvecklingen av antibiotikaresistenta bakterier, och dessa nu utgör ett allvarligt hot mot folkhälsan i det 21: a århundradet. Ökningen av bakteriestammar som är resistenta mot de flesta behandlingsalternativ ökar möjligheten vi går in i en era där antimikrobiella läkemedel inte längre är effektiva 1,2.
Den genetiska maskiner som ger antibiotikaresistens är ett gammalt system, predating människor och antibiotikaselektionstryck av miljontals år 3. Mobila genetiska element, såsom plasmider, transposoner, iska öarna, integrativa konjugering element och integroner kan sprida antibiotikaresistensgener (ARG) både inom och mellan bakteriearter 4. Av dessa har integroner spelat en central roll i spridningen av ARG, trots denfaktum att de förlitar sig på plasmider och transposoner för mobilisering och införande i bakteriegenom 5. Integroner fånga genkassetterna använder en integron-integras, och sedan uttrycka kassetter med hjälp av en integron kodad promotor 6,7 (Figur 1). Integron genkassetterna är små rörliga element som består av enskilda öppna läsramar (ORF) vars produkter kan ge resistens mot antibiotika eller desinfektionsmedel 8. Klass 1 integroner är integroner oftast återhämtat sig från kliniska isolat 5, där de tillsammans har förvärvat över 130 olika antibiotikaresistens genkassetterna 9.
Spridningen av klass 1 integroner i humana associerade commensal och patogena bakterier genererar avfallsströmmar mänskliga som innehåller ett stort antal av dessa genetiska element 10. Uppskattningsvis 10 19 bakterier som innehåller klass 1 integroner släpps via avloppsslam varje år in Förenade kungariket 11. Det är därför inte förvånande att klass 1 integroner som ger antibiotika motstånd nu detekteras i mikrobiota av vilda fåglar, fiskar och andra inhemska vilda djur 12-14. Släpper integroner tillbaka till miljön utgör ett allvarligt hot mot folkhälsan, eftersom förvärv av nya genkassetterna och komplexa omlagringar med andra rörliga element kvarstår, särskilt i vattenreningsverk och andra vattendrag 15-18. Den naturliga miljön blir då en grund bördig rekrytera nya resistensbestämningsfaktorer och opportunistiska patogener 19,20. Nya integron innehåller bakterier och nya ARGumenten kan ringa tillbaka till den mänskliga gemenskapen genom förorenat vatten och mat 21,22. Övervakning av miljö ARGumenten är en viktig strategi för att förstå och hantera antibiotikaresistens i framtiden 23. Framför allt bör uppmärksamhet ägnas åt livsmedel som äts råa ellerlätt kokta, eftersom dessa presenterar det största hotet för överföring av nya mobila element och patogener.
I detta protokoll, en rationell metod för att upptäcka, identifiera och karakterisera klass 1 integroner och tillhörande genkassetterna i livsmedel beskrivs (Figur 2). Med en kombination av odling och polymerase chain reaction (PCR), kan integroner snabbt upptäcks i komplexa bakteriesamhällen och enskilda isolat. Metoder för identifiering av arter av bakterier och konformationen och identiteten hos integron associerade genkassetterna ges. Metoden är lämplig för ett brett spektrum av växt- och djurmatar, och exempel på typiska arbetsflöden ges för var och en av dessa typer av livsmedel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifieringen av integroner och tillhörande genkassetterna är potentiellt ett viktigt steg i att förutsäga uppkomsten av nya opportunistiska patogener, spåra vägar för patogener i livsmedelskedjan, och identifiera nya motstånd och virulensdeterminanter 8,21,26. Syftet med denna uppsats var att beskriva en rationell metod för screening av prover för klass 1 integroner, karakterisera deras kassett matriser och identifiera bakteriearter där de är bosatta. Kritiska steg i protokollet innebär god mi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tack vare Michaela Hall, Larissa Bispo och Gustavo Tavares för tekniskt bistånd.
Materials
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Used in all PCRs |
| RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) | Sigma | R6513-10MG | Used in all PCRs |
| HinFI restriction enzyme | Promega | R6201 | Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA |
| 100 bp ladder | GE Healthcare | 27400701 | Used as a size standard on all agarose gels |
| GelRed DNA stain | Biotium | 41003 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| Guanidinium Thiocyanate | Life Technologies | AM9422 | CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material |
| CLS-TC Solution | MP Biomedicals | 6540409 | Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction |
| Lysing Matrix E FastPrep tubes | MP Biomedicals | 116914500 | Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available. |
| binding matrix | MP Biomedicals | 116540408 | Diluted 1:5 with 6M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method. |
| Fast Prep machine | MP Biomedicals | Number of options available | MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information |
References
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
- Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
- Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
- Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
- Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
- Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
- Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
- Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
- Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
- Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
- Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
- Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
- Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
- Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
- Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
- Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
- Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
- Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
- Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
- Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
- Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what’s new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
- Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
- Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
- Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
- Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
- Lane, D. J. . Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , 115-175 (1991).
- Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).
