Screening næringsmidler for klasse 1 integroner og Gene Kassetter

Summary

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Abstract

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21^st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

Introduction

Oppdagelsen av antibiotika var en av de største vitenskapelige prestasjoner av det ^20. århundre. Imidlertid har bruk og misbruk av antibiotika har ført til den raske utviklingen av antibiotikaresistente bakterier, og disse nå utgjør en alvorlig trussel mot folkehelsen ⁱ det 21. århundre. Framveksten av bakteriestammer resistente mot de fleste behandlingstilbud øker muligheten vi går inn i en tid der antimikrobielle stoffer er ikke lenger effektive ^1,2.

Den genetiske maskiner som overfører antibiotikaresistens er et gammelt system, predating mennesker og antibiotika seleksjonstrykk av millioner av år ^3. Mobile genetiske elementer, som plasmider, transposoner, genomiske øyer, integrerende konjugativt elementer og integroner kan spre antibiotikaresistensgener (ARG) både innenfor og mellom bakteriearter ^4. Av disse har integroner spilt en sentral rolle i spredningen av ARG, til tross fordet faktum at de er avhengige av plasmider og transposoner mobiliserings- og innsetting inn i bakterielle genomer ^5. Integroner fange genkassetter ved hjelp av en integron-integrase, og deretter uttrykke kassetter ved hjelp av en integron kodet promoter ^6,7 (figur 1). Integron genet kassetter er små mobile elementer som består av enkelt åpne leserammer (ORF) hvis produkter kan gi resistens mot antibiotika eller desinfeksjonsmidler ^8. Klasse 1 integroner er integroner oftest utvinnes fra kliniske isolater ^5, hvor de har samlet ervervet over 130 forskjellige antibiotikaresistens genkassetter ^9.

Spredningen av klasse 1 integroner inn i menneskelige-forbundet commensal og patogene bakterier genererer menneskelige avfallsstrømmer som inneholder store mengder av disse genetiske elementer ^10. Anslagsvis 10 ¹⁹ bakterier som inneholder klasse 1 integroner frigis via kloakkslam hvert år jegn Storbritannia ^11. Det er derfor ikke overraskende at klasse 1 integroner overdragelse antibiotika motstander blir nå påvist i bakterieflora av ville fugler, fisk og andre lokale dyrelivet ^12-14. Releasing integroner tilbake i miljøet utgjør en betydelig helsetrusselen, siden kjøpet av nye genet kassetter og komplekse rearrangements med andre mobile elementer vedvarer, særlig i kloakkrenseanlegg og andre vassdrag ^15-18. Naturmiljøet blir da en fruktbar for rekruttering til nye resistens og opportunistiske patogener ^19,20. Nye integron inneholder bakterier og nye args kan sirkel tilbake til det menneskelige fellesskap gjennom forurenset vann og mat ^21,22. Overvåking av miljø args er en viktig strategi for å forstå og håndtere antibiotikaresistens i fremtiden ^23. Særlig oppmerksomhet bør rettes mot matvarer som spises rå ellerlett tilberedes, fordi disse frem den største trusselen for overføring av nye mobile elementer og patogener.

I denne protokollen, en strømlinjeformet tilnærming for å påvise, identifisere og karakterisere klasse 1 integroner og deres tilknyttede genet kassetter i næringsmidler er skissert (figur 2). Ved hjelp av en kombinasjon av dyrking og polymerase chain reaction (PCR), kan integroner bli raskt oppdaget i komplekse bakteriesamfunn og enkelte isolater. Fremgangsmåter for identifisering av arter av bakterier og konformasjon og identiteten til de integron-assosierte genkassetter er gitt. Fremgangsmåten er egnet for et bredt spekter av plante- og animalske matvarer, og eksempler på typiske arbeidsflyter er gitt for hver av disse typer mat.

Protocol

Matvarer som spises rå eller lett kokte er av mest interesse for menneskers helse. Eksempler inkluderer salat grønnsaker, frukt, skalldyr og krepsdyr. 1. Prøvetaking Samle inn prøver under betingelser som minimerer kontaminering og lagres i separate, rene poser under transport. Når oppsamlet, må prøvene lagret ved 4 ° C og behandles i løpet av 24 timer. 2. Beriket Kultur Forberedelse Frukt og grønnsaker: Plasser tiln…

Representative Results

Screening av blandede kulturer og bakterieisolater for intI1 Primersett HS463a / HS464 PCR kan brukes for å påvise tilstedeværelse av klasse 1 integron-integrase gen, intI1 (figur 1). Denne primer settet fungerer godt for å detektere intI1 i blandede kulturer, og blir også brukt til å screene bakteriekolonier som er høstet fra spredningsplater (figur 2). Positive isolater skal generere en enkelt sterkt band på 471 bp bruke denne primer…

Discussion

Identifiseringen av integroner og deres tilknyttede genet kassetter er potensielt et viktig steg i å forutsi fremveksten av nye opportunistiske patogener, sporing trasé for patogener i den menneskelige næringskjeden, og identifisere nye motstand og virulens determinanter ^8,21,26. Målet med denne artikkelen var å beskrive en strømlinjeformet tilnærming for screening prøver for klasse 1 integroner, karakteriserer sine kassett arrays og identifisere bakteriearter der de bor. Kritiske trinn i protokollen …

Materials

GoTaq Colourless Mastermix	Promega	M7132	Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas)	Sigma	R6513-10MG	Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme	Promega	R6201	Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder	GE Healthcare	27400701	Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain	Biotium	41003	CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium Thiocyanate	Life Technologies	AM9422	CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution	MP Biomedicals	6540409	Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes	MP Biomedicals	116914500	Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
binding matrix	MP Biomedicals	116540408	Diluted 1:5 with 6M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine	MP Biomedicals	Number of options available	MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information