Un alto rendimiento y sistema de expresión de costo-eficiente de granzimas humanos en células de mamífero
Summary
We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.
Abstract
When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.
Introduction
Los Gzms son una familia de serina proteasas altamente homólogas localizadas en los lisosomas especializados de CTL y células NK 1. Los gránulos citotóxicos de estas células asesinas también contienen las proteínas de la membrana de alteración PFN y GNLY que se liberan simultáneamente con los Gzms en el reconocimiento de una célula diana destinada para la eliminación de 2,3. Hay cinco Gzms en humanos (GzmA, B, H, K y M), y 10 Gzms en ratones (GzmA – G, K, M y N). GzmA y GzmB son los más abundantes y ampliamente estudiado en seres humanos y ratones 1. Sin embargo, estudios más recientes han comenzado a investigar las vías de muerte celular, así como los efectos biológicos adicionales mediadas por los otros llamados Gzms, huérfanos en la salud y la enfermedad 4.
La función mejor conocida de las Gzms, en particular de GzmA y GzmB, es la inducción de la muerte celular programada en células de mamíferos cuando se entrega en las células diana por PFN 5,6. Sin embargo, Estudios más recientes también demostraron efectos extracelulares de los Gzms con profundo impacto en la regulación inmune y la inflamación, independientemente de la entrega citosólica por PFN 7,8. El espectro de las células que mueren de manera eficiente después de la entrada citosólica de las Gzms también fue recientemente se amplió a partir de células de mamíferos a las bacterias 9,10 e incluso ciertos parásitos 11. Estos recientes descubrimientos abrieron un campo completamente nuevo para los investigadores GZM. Por lo tanto, un sistema de expresión de mamíferos de alto rendimiento rentable aliviará significativamente el camino para los estudios futuros.
Humanos, de ratón y de rata Gzms nativos se han purificado con éxito de la fracción de gránulos de CTL y NK células líneas 12-14. Sin embargo, en nuestras manos el rendimiento de tales técnicas de purificación está en el intervalo de menos de 0,1 mg / L de cultivo celular (observación no publicada y 12). Además, la resolución cromatográfica de un solo Gzm sin contaminación por other Gzms y / o proteínas que también están presentes en los gránulos es un reto (datos no publicados y 12,14). Gzms recombinantes se producen en bacterias, levaduras 15 16, células de insecto y en 17 incluso en las células de mamífero tales como HEK 293 18,19. Sólo los sistemas de expresión de mamífero tienen el potencial de producir enzimas recombinantes con modificaciones postraduccionales idéntica a la proteína citotóxica nativo. Modificaciones postraduccionales han sido implicados con la captación específica por endocitosis y la localización intracelular de la proteasa dentro de las células diana 20-22. Por lo tanto, mediante el uso de pHLsec 23 (una especie de regalo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, de la Universidad de Oxford, Reino Unido) como la columna vertebral plásmido para la expresión Gzm, establecimos un sistema simple, tiempo y costo eficiente para la producción de proteínas de alto rendimiento en células HEK293T. pHLsec combina un promotor de CMV con un promotor-Β-actina de pollo; En conjunto, estos elementos demostrated el más fuerte promotor de la actividad en diversas líneas celulares 24. Además, el plásmido contiene un intrón de conejo Β-globina, señales de secreción y Kozak optimizada, una Lys-6xHis-tag y un poli-A de la señal. Los insertos se pueden clonar convenientemente entre la señal de secreción y la 6xHis-Lys-tag (Figura 1) asegurar la expresión óptima y eficacia de secreción para proteínas que carecen de dominios N-terminales apropiados. Para la expresión de los Gzms, que sustituye la secuencia señal de secreción endógena con la señal de secreción proporcionada por el vector seguido por una enteroquinasa (EK) sitio (DDDDK), de modo que el tratamiento EK activado el Gzms secretadas (Gzms activos comenzar con el N-terminal secuencia de aminoácidos IIGG 25). Adicionalmente a favor de este método, las células HEK293T crecen rápidamente en un medio de bajo precio, como medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), y son muy adecuadas para el método de transfección de fosfato de calcio rentable.
Protocol
Representative Results
Discussion
El papel clásico y ampliamente estudiado de GzmA y GzmB es la inducción de apoptosis en células de mamífero después de su entrega citosólica por la proteína formadora de poros PFN 1. Recientemente, el espectro citotóxica de los Gzms se amplió de manera significativa a partir de células de mamíferos a las bacterias 9,10, así como a ciertos parásitos 11. Además, las funciones no clásicos, extracelulares de GzmA y GzmB así como la importancia biológica de los diversos Gzms …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Schürpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5ml-column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml-column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
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