Microfluidique génipine dépôt Technique de la culture avancée de microélectrodes vasculaires musculaires Thin Films

Summary

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Abstract

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.

Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

Introduction

Les maladies vasculaires, tels que le vasospasme cérébral ^{1,2, 3} hypertension, l'athérosclérose et ^4, se développent lentement, sont généralement de nature chronique, et impliquent dysfonctionnel génération de force par les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Nous visons à étudier ces dysfonctionnements vasculaires progresse lentement à l'aide de méthodes in vitro avec un contrôle plus fin des conditions expérimentales que les modèles in vivo. Films musculaires vasculaires Nous avons déjà développés minces (vMTFs) pour mesurer la contractilité fonctionnelle in vitro conçus tissus cardiovasculaires ^5, mais cette méthode a été limitée à des études à relativement court terme. Ici, nous présentons une technique de modification du substrat qui élargit notre technique vMTF précédente pour les mesures à long terme.

Bien que l'endothélium est également critique en fonction globale vasculaire, lamelles artérielle conçue fournir un système de modèle utile pour évaluer les changements dans vasculairecontractilité pendant la progression de la maladie. Pour concevoir un modèle de tissu de maladie vasculaire fonctionnel, à la fois la structure et la fonction de la lamelle artériel, l'appareil contractile de base de la cuve, doit être récapitulé avec une grande fidélité. Arterial lamelles sont concentriques feuilles de CMLV contractiles séparées par des feuilles de ⁶ élastine, la circonférence-alignés. L'impression par microcontact de la matrice extracellulaire (MEC) protéines sur polydiméthylsiloxane (PDMS) substrats a déjà été utilisé pour fournir des signaux de guidage pour l'organisation des tissus pour imiter aligné tissu cardiovasculaire ^5,7-10. Cependant, tissus à motifs en utilisant l'impression microcontact peuvent perdre leur intégrité après 3-4 jours de culture, limitant leur applicabilité dans les études chroniques. Ce protocole fournit une solution à ce problème en remplaçant les techniques d'impression par microcontact précédentes avec une nouvelle technique de dépôt microfluidique.

Genchi et al. PDMS substrats modifiés avec génipine et found viabilité des myocytes prolongée jusqu'à un mois dans la culture ^11. Ici, nous utilisons une approche similaire pour étendre la culture de cellules motifs musculaires lisses vasculaires sur PDMS. Génipine, un dérivé hydrolytique naturelle du fruit de gardénia, est un candidat souhaitable pour la modification du substrat en raison de sa toxicité relativement faible par rapport aux agents de reticulation similaires et son utilisation croissante comme biomatériau dans les domaines de la réparation des tissus ^12,13 et modification de l'ECM ^{14, 15.} Dans ce protocole, la fibronectine est utilisée comme repère de guidage de la cellule, comme dans les méthodes d'impression par microcontact précédentes; Toutefois, génipine est déposé sur PDMS substrats antérieurs à la fibronectine structuration. Ainsi, comme les cellules dégradent la matrice à motifs, ECM nouvellement synthétisé à partir de CMLV attachés peut se lier au substrat de PDMS génipine revêtu.

Ce protocole utilise un dispositif de délivrance pour la génipine microfluidique en deux étapes et le dépôt ECM. La conception du dispositif microfluidique imite microcomotifs d'impression NTACT utilisés pour lamelles artérielle conçu dans les études précédentes ^16. Ainsi, nous nous attendons à ce protocole pour obtenir imite artérielle de lamelles qui récapitulent avec succès le très-alignés dans la structure in vivo et de la fonction contractile du artérielle lamelles. On évalue également la contractilité du tissu afin de confirmer que la génipine est un composé de modification de substrat approprié pour le long terme dans des modèles de maladies vasculaires in vitro.

Protocol

Remarque: L'objectif de ce protocole est de construire et d'utiliser un film vasculaire musculaire mince (vMTF) avec la structure représentée sur la figure 1 pour évaluer la contractilité pendant la culture prolongée de cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sur PDMS substrats. Pour prolonger CMLV viabilité, nous utilisons l'génipine composé de réticulation. Les substrats de ces vMTFs sont conçus pour analyser la contractilité des tissus tels que développés par Grosberg …

Representative Results

L'objectif principal de ce travail était d'étendre la viabilité de CMLV microélectrodes sur PDMS substrats hydrophobes. Ceci a été accompli en incorporant un système de délivrance pour déposer microfluidique génipine à motifs et de la fibronectine sur PDMS (figure 1). Dépôt de protéines ECM en utilisant la livraison microfluidique a abouti à un transfert de haute fidélité du modèle de canal avec PDMS nus entre les lignes de génipine et de la fibronectine (figure 1D).</…

Discussion

Ici, nous présentons un protocole qui repose sur la technologie vMTF précédemment développé, permettant des temps d'expérimentation prolongées plus typique des voies de maladies vasculaires chroniques ^1,23,24. Pour ce faire, nous motif fin génipine, qui a été montré précédemment pour fournir fonctionnalisation à long terme des substrats PDMS ^11, en ​​utilisant une technique de dépôt microfluidique pour produire des lamelles artérielle d'ingénierie avec amélioration de…

Materials

Coverslip staining rack	Electron Microscopy Sciences	www.emsdiasum.com/	72239-04	Alternative coverslip rack may be used
Microscope cover glass – 25 mm	Fisher Scientific, Inc.	www.fishersci.com	12-545-102	Alternative brand and size may be used; Microscope slides may also be substituted as substrate base
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Polysciences, Inc.	www.polysciences.com/	#21458	Sigma-Aldrich makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol; Compound gives strong odor, use proper ventilation
1-butanol	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	360465	Hazard: flammable (store stock solution in flammable cabinet); flash point is 37 °C, avoid heating; alternative product may be used
Spincoater	Specialty Coating Systems, Inc.	www.scscoatings.com		SCS G3P8 Model; Alternative brand and/or model may be used
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives (Dow Corning)	www.ellsworth.com	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Alternative distributor may be used
Fluorescent microbeads	Polysciences, Inc.	www.polysciences.com/	17151	Alternative brand and/or larger size may be used
Silicon wafers	Wafer World, Inc.	www.waferworld.com	2398	Alternative brand and/or size may be used
Photoresist	MicroChem Corp.	www.microchem.com		SU-8 3025 allows 20-25-µm feature height
Contact mask aligner	Suss MicroTec	www.suss.com		MA6 contact mask aligner; alternative brand and/or model may be used for wafer exposure
Developer	MicroChem Corp.	www.microchem.com		SU-8 Developer; Hazard: flammable
Tridecafluro-trichlorosilane	UCT Specialties, Inc.	www.unitedchem.com	T2492	Silane for non-stick coating of patterned silicon wafers (CAUTION: Tridecafluro-trichlorosilane is a flammable and corrosive liquid. Proper personal protective equipment and local exhaust is necessary for use. )
Surgical biopsy punch	Integra LifeSciences Corp.	www.miltex.com	33-31AA-P/25	Alternative brand and/or size may be used
Genipin	Cayman Chemical	www.caymanchem.com	10010622	Sigma-Aldrich (G4796-25MG) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol
1X phosphate buffered saline	Mediatech, Inc.	www.cellgro.com	21-031-CV	Alternative brand may be used
Fibronectin	Corning, Inc.	www.corning.com	356008	Sigma-Aldrich (F1056) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Inc.	www.lifetechnologies.com	15140-122	Alternative brand and/or size may be used, as long as concentration is the same
Umbillical artery smooth muscle cells	Lonza	www.lonza.com	CC-2579	Alternative cell types may be used for alternative applications. Media should be modified accordingly
Tyrode's solution components	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	various	Alternative brand may be used for mixing solution
Stereomicroscope	Zeiss	www.zeiss.com	4350020000000000	SteREOLumar V12; Alternative brand/type of stereomicroscope may be used
Temperature-controlled platform	Warner Instruments	www.warneronline.com	641659; 640352; 641922
Endothelin-1	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	E7764-50UG	Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained
HA-1077	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	H139-10MG	Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained