我々は、3次元再構成人間の角膜のような上皮(RHCE)組織モデルを利用した眼刺激性試験を開発しました。テストは、眼刺激性及び腐食性物質(GHSカテゴリー1と組み合わせた2)とラベル(GHSなしカテゴリ)を必要としないものとを区別することができます。
EU化粧品指令、欧州REACH法規に第七改正に準拠するために、ヒトの眼毒性の信頼性と正確な評価のための検証非動物代替の方法が必要とされています。このニーズに応えるために、我々は正常なヒト細胞に基づいて3次元再構成人間の角膜のような上皮(RHCE)組織モデルを利用した眼刺激性試験(EIT)を開発しました。 EITは、眼刺激物や腐食(GHSカテゴリー1と2を組み合わせ)とラベリング(GHSなしカテゴリ)を必要としないものを分離することができます。テストは、2つの別々のプロトコル、液体化学物質と第二のために設計された1つ、固体試験物品のための同様のプロトコルを利用しています。 EIT予測モデルは、単一の露光期間(液体で30分間、固形分6時間)、および単一の組織の生存率のカットオフ(MTTアッセイによって決定される60.0%)を使用します。 EITは95.5 / 68.2 / 81.8パーセントとのSENSを達成した(44液体および固体39)83化学物質の結果に基づいて、液体用itivity /特異性と精度(SS&A)、100.0 / 68.4 / 84.6パーセントとSS&A固体用、および97.6 / 68.3 /と全体のSS&Aの83.1パーセント。 EITは、規制テスト要件を満たすために、動物を使用することなく、液体及び固体の化学物質の広範囲の眼刺激性を分類に大きく貢献します。 EpiOcular EIT法は、TG 492としてOECDテストガイドラインに2015年に実施されました。
このような化粧品、洗剤、家庭用クリーナーとして消費者製品は、彼らが目に連絡した場合、重大な損傷を誘発する可能性が種々の化学物質が含まれています。そのため、目への刺激のためのこれらの薬剤のテストは、消費者の安全を確保するための1、米国とEUの規制当局によって必要とされます。混合物および製剤の眼刺激性の評価はまた、化学物質の輸送のためのEUの化粧品指令の下で化粧品成分の標識のためにREACH(登録、評価、認可および化学物質の使用制限)法律を遵守する要件である、とのために殺虫剤や家庭用製品2のラベル。現在、規制当局は、化学品の分類およびラベリングに関する世界調和システム(GHS)3を用いて、眼のハザード評価が必要です。 GHSは、主にドレイズ眼刺激性試験に基づいており、最も広く使用されている眼刺激アッセイもので異物とマイルxturesは、ウサギの眼4の結膜嚢に直接導入されています。 GHS分類によると、GHS区分1(眼腐食)は、露光3,5以下の21日以内に眼の組織または完全に可逆的ではない、目と視力に重大な損傷に深刻な最初の損傷の原因となる化学物質をテストすることを指します。 GHS区分2は、露出の21日以内に完全に可逆的で目に有意な変化を生じる化学物質をテストすることを指します。腐食性または刺激性物質ではない試験化学物質はGHSはありませんカテゴリと呼ばれています。
40年以上にわたり、ドレイズウサギの目のテストでは、その再現性の欠如、人間の応答の過大評価、そして生きている動物5-8の使用のために批判されています。これらの懸念は、洗練、縮小、およびin vivo試験 9の交換のための多くの提案を奨励しています。検証非動物代替物の必要性がさらに強化されました(2009年)化粧品(2005年)化粧品の安全性評価における動物の使用を禁止指令、および成分に第七改正の採用により2。
1996年から、再構成された角膜のような組織モデルは、広く目、原料、界面活性剤ベースの製剤、および、または近傍で使用するために設計された配合混合物の刺激性を評価するために化粧品業界で使用されています10-13。 RHCEの組織モデルの使用は、その本来の、希釈しない形で、組織表面への試験物質の直接局所適用することができます。この方法では、非水溶性製剤は溶剤でそれらを希釈することなく試験することができます。 (代替法の検証のための欧州連合(EU)のリファレンスラボラトリーヨーロッパセンター)EURL ECVAMのに対応して広く、該当簡単で、経済法の要求SINGLを利用眼刺激性試験(EIT)電子露光時間とラベリングを必要としない材料から眼刺激物や腐食を分離することができる(図1)14を開発しました。 83化学物質(44液体および39固体)の結果をもとに、EITは95.5 / 68.2 /と81.8パーセントの感度/特異度と精度(SS&A)液体のため、固体のための100.0 / 68.4 /と84.6パーセントSS&A、および97.6を/達成しました68.3 /と全体のSS&Aの83.1パーセント。
2007年には、EURL ECVAMの後援化粧品ヨーロッパ(旧COLIPA)が主催する多実験室前の検証研究では、正式な検証15にそれをもたらすことを目的としたEITの妥当性と信頼性を評価しました。本研究では、298の独立した試験では、7つの独立の研究室で行いました。研究結果は、すべての参加研究室15全体の変動の低い係数の予測で99.7%の契約を実証しました。その結果、2010年にはEITプロトコルは正式なEURL ECVAMに入りました検証プログラム。バリデーション試験は、in vivoでの参照データ(ドレイズ眼刺激性データ)が利用可能であった対象の個々の物質と化学の混合物、を含む104コード化されたテスト化学物質を利用しました。この作品の成功に基づき、OECDドラフトテストガイドラインには、それは、EITは、国連GHS分類および表示システムによる材料の広い範囲の眼刺激性の分類に大きく貢献することが期待される2014年に提出されました。
我々はEpiOcular組織モデルのために開発された眼刺激性試験( 図1)を提示しています。 GHS区分とを区別しない、本明細書に提示されるようEITは、感度と特異17 EITを度の高いラベル(GHSなしカテゴリ)を必要としない材料から眼刺激物や腐食(GHSカテゴリー1と2を組み合わせ)を分離することができます1カテゴリからの2物質。 EITは、化粧品および医薬成分を含む化学物質の広い範囲の眼刺激性の分類と表示のために検証されました。他のin vitro試験に関連して、EITは、in vivoウサギ眼刺激性試験の代替として機能します。
EITは露光および露光後のインキュベーション期間の長さ( 図1)に変化する液体および固体材料のための2つの類似するが異なるプロトコルを使用します。 EITで使用するエンドポイント以前に検証されたヒト上皮組織モデル20,21で使用されているMTTアッセイによって決定し、組織の生存率です。このアッセイを行うために、標準的な細胞培養装置の他に特別な装置が必要とされません。高い組織対組織の再現性のレベル、n = 2の組織の代わりに通常推奨されるN = 3が使用されます。それはそれによって個々の組織14の異なる取り扱いをすると生じる可能性がアッセイのばらつきを最小限に抑え、同時に2つの組織を処理するために、経験豊富なオペレータを可能にするため、2組織を使用し、N =能力は、プロトコルの重要な側面です。また、陽性対照および陰性対照と一緒に、被験物質あたりn = 2の組織、同一の物理的状態(液体または固体)の10の試験物質の刺激を用いて、1キット(24組織)を用いて評価することができます。
材料の信頼性の分類を確保する他の重要なポイントは、陽性コントロールのsuの仕様ですbstance(組織生存率≤50.0%)、重複した組織(差<20.0%)、およびネガティブコントロールOD読み取り値(> 0.8 <2.5)との間の再現性。
EIT試験を行う場合、インキュベーション期間中にプロトコルまたは変化の偏差が変化した結果をもたらすことができるので、それは、検証プロトコルと推奨投薬およびすすぎスケジュール( 表3および4)に接着することが重要です。同様に、MTTインキュベーションのための3時間の時間からの偏差は異なるMTTの読みになり、アッセイの結果に影響を与える可能性があります。
時折、試験化学物質は、MTT組織生存率アッセイ又はMTTの原因の減少を妨害することができる光学的または他の特性を有していてもよいです。例えば、試験化学物質を直接青紫色の反応生成物にMTTを低減することができる、またはMTTホルマザン(〜570ナノメートル)と同じ範囲の光を吸収する着色された物質であってもよいです。しかし、これらの試験の化学物質はPRますMTTアッセイの際に、材料の十分な量は、依然として上に存在する(またはによって吸収)である場合にのみ、組織の問題をESENT。この干渉を回避するために、大規模な洗浄手順は、EITプロトコルに組み込まれています。すすぎはTAを削除しないとTAはMTT還元を妨害した場合、追加のコントロールはそれを検出し、修正するために使用されなければなりません。被験物質の直接MTT還元が疑われる場合に簡単に説明すると、当該化学物質の50μlの(又は固体50 mg)をSCC(NC、滅菌脱イオン水50μlで作業MTT溶液で3時間インキュベートする、であるべきです同時に実行)。 MTT溶液が青紫色になった場合、試験物品を、MTTが低下していると推定されます。この場合、凍結殺し組織コントロールを使用して機能的なチェックは、試験物質は、組織に結合し、偽のMTT低減信号に先行しているかどうかを評価するために行われるべきです。 TA-さらされ、殺された組織制御でかなりのMTT還元がある場合(未処理の生存組織内の量に対して)、試験品の平均組織の生存率は、殺された対照の平均生存率を差し引くことにより補正しなければなりません。
偽陰性分類14,15,18の発生率が低いことによって実証されるように、EITは、安全性の側面に誤差が生じるが。重要なのは、目には腐食性であり、GHS区分1の化学物質のいずれもが、最も深刻な眼の危険性を表していませんこのアッセイ14,15,18,19に非刺激性として分類されました。最後に、 インビトロ試験方法で RHCEの主要な利点の一つは、原液と(2次元、沈められた細胞培養物では不可能である)固体材料を試験する可能性があります。
EITは、国連GHS分類および表示システムによる材料の広い範囲の眼刺激性を決定する際に重要な一因になります。 Oを決定するために、動物の交換cular毒性は、長年にわたって毒物学研究の目標でした。 EIT試験方法は、2014年にEURL ECVAMでサポートされている正式なバリデーション試験を完了したとEpiOcular EITは、2015年にはOECD TG 492としてOECDテストガイドラインに実装されました。
The authors have nothing to disclose.
著者は、EITプロジェクト専用の彼の科学的な支援と時間のためにドクター・ジョンHarbellに感謝したいと思います。著者らはまた、バイヤスドルフAG(ドイツ)、IIVS(米国)、メアリーケイ社(米国)、エイボンプロダクツ社(米国)、プロクター・アンド・ギャンブル/ Cosmital(スイス)、ラボラトリーピエール・ファーブル(フランス)に感謝したいと思いますハーランラボラトリーズ(イギリス)、および眼刺激性試験15の多施設国際事前検証と検証研究に参加するためのLVMH Parfume(フランス)。