Fabricação de uma baseada em PCL Bioativos, "Self-fitting" Memória de Forma Polymer Andaime

Summary

Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.

Abstract

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.

Introduction

Atualmente considerada o padrão ouro do crânio-maxilo-facial (CMF) Tratamentos de defeito ósseo, o transplante de enxerto autólogo colhido é prejudicado por procedimentos de enxerto complexos, área doadora morbidade e disponibilidade limitada ^1. Uma dificuldade particular está a moldar e que fixa o auto-enxerto rígida firmemente no defeito de modo a obter a osteointegração e para evitar a reabsorção do enxerto. A engenharia de tecidos tem sido investigado como uma estratégia alternativa a auto-enxertia e substitutos ósseos artificiais (por exemplo, cimento ósseo) ^2,3. Crítica para o sucesso de uma abordagem de engenharia de tecidos é um andaime com um conjunto específico de propriedades. Em primeiro lugar, a fim de alcançar a osteointegração, o andaime deve formar um contacto estreito com o tecido ósseo adjacente ^4. O andaime também deve ser osteocondutor, permitindo a migração celular, difusão de nutrientes e neotissue ^4,5 deposição. Este comportamento é geralmente conseguida com sca biodegradávelffolds exibindo uma morfologia de poro altamente interligada. Por último, o andaime deve ser bioativa, de modo a promover a integração e ligação com áreas de tecido ósseo ^5.

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar um andaime engenharia de tecidos com estas propriedades. Importante, este andaime exibe a capacidade de "auto-ajuste" em CMF irregulares defeitos, devido ao seu comportamento com memória de forma ^6. Polímeros com memória de forma Thermoresponsive (SMPS) são conhecidos por sofrerem alteração da forma, por exposição ao calor ^7,8. SMPs são compostas de "pontos de Netpoint" (isto é ligações cruzadas físicas ou químicas) que determinam a forma permanente e "segmentos de comutação" que mantêm a forma temporária e recuperar a forma permanente. Os segmentos de comutação exibem uma temperatura de transição térmica (t _trans) correspondente, quer ao de transição vítrea _(Tg) de transição ou fusão _(Tm) do polímero. Comoresultado, SMPs pode ser deformado sequencialmente em uma forma temporária no T> T _trans, fixado na forma temporária no T <T _trans, e recuperou-se à forma permanente no T> T _trans. Assim, um andaime SMP poderia conseguir "auto-ajuste" dentro de um defeito CMF da seguinte ^6. Após a exposição a aquecer salina (T> T _trans), um andaime SMP iria se tornar maleável, permitindo uma cilíndrico andaime genericamente preparado para ser em um defeito irregular mão-pressionado, com recuperação de forma promovendo a expansão do andaime para o limite defeito. Com o arrefecimento (T <T _trans), o andaime voltaria ao seu estado relativamente mais rígida, com forma fixidez manter sua nova forma temporária dentro do defeito. Neste protocolo, um andaime SMP é preparado a partir de policaprolactona (PCL), um polímero biodegradável estudado extensivamente para a regeneração de tecidos e outras aplicações biomédicas ^9-11. Para memória de forma, thE T _{M de} PCL serve como a _trans t e varia entre 43 e 60 ° C, dependendo do peso molecular do PCL ^12. Neste protocolo, o T _trans (ou seja, T _m) do andaime é 56,6 ± 0,3 ºC ^6.

A fim de alcançar osteocondutividade, foi desenvolvido um protocolo para fazer andaimes SMP baseados em PCL com poros altamente interligados com base num método de fundição ^{6,13,14-solvente} partículas de lixiviação (SCPL). Diacrilato de policaprolactona (PCL-DA) (M = _N ~ 10000 g / mol) foi utilizado para permitir a rápida, reticulação fotoquímica e foi dissolvido em diclorometano (DCM) para permitir-solvente sobre o molde de fundição de sal. Após cura fotoquímica e evaporação do solvente, o molde sal foi removido por lixiviação em água. O tamanho médio de sal regula o tamanho de poro andaime. Mais importante, o modelo de sal foi fundido com água antes de o solvente de fundição para alcançar poro interconnectivity.

A bioactividade foi conferida ao andaime SMP pela formação in situ de um revestimento nas paredes dos poros polydopamine ^6. A bioactividade é frequentemente introduzido no andaimes pela inclusão de vidro ou de vidro cerâmico de enchimento ^15. Contudo, estes podem dar origem a propriedades mecânicas indesejadas quebradiças. A dopamina tem sido mostrado para formar, uma camada aderente fina polydopamine em uma variedade de substratos ^16-19. Neste protocolo, o andaime PMS foi submetido a uma solução ligeiramente básica (pH = 8,5) de dopamina para formar um revestimento de polydopamine nanothick em todas as superfícies de parede do poro ^6. Além de aumentar a hidrofilicidade da superfície para melhorar a adesão e espalhamento, polydopamine tem sido mostrado para ser bioactivo em termos de formação de hidroxiapatite (HAp) após exposição ao fluido corporal simulado (SBF) ^18,20,21. Num último passo, o andaime revestido é exposto a um tratamento térmico a 85 ° C (T> T _trans) WHich leva a scaffold densificação. O tratamento térmico foi observado anteriormente a ser essencial para o comportamento de memória de forma andaime, talvez devido a domínios cristalinos PCL reorganizando a maior proximidade ^14.

Nós descrevemos adicionalmente os métodos para caracterizar o comportamento de auto-montagem dentro de um defeito modelo irregular, moldar o comportamento de memória em termos de ensaios de compressão mecânica cíclico térmicos com deformação controlada (isto é, recuperação da forma e moldar fixidez), morfologia de poros, e de bioactividade in vitro. São também apresentadas estratégias para adequar propriedades de andaime.

Protocol

1. Sintetizando PCL-DA Macrómero Execute a reação acrylation. Pesar 20 g de PCL-diol (M n = ~ 10000 g / mol) em frasco de 250 ml de fundo redondo equipado com uma barra de agitação magnética coberta de teflon. Dissolve-se o PCL-diol em DCM. Adicionar 120 mLlof DCM para o frasco (concentração = 0,17 g / ml). Coloque um septo de borracha frouxamente dentro do gargalo do frasco de modo a evitar a acumulação de pressão enquanto também previne a evapora?…

Representative Results

O resultante PMS andaime baseado no PCL é capaz de auto-montagem em um modelo de defeito de CMF (Figura 2). Depois de uma breve exposição a aquecer salina (~ 60 ° C), o andaime cilíndrica amolece permitindo que a escora seja pressionada manualmente para dentro e para expandir dentro do defeito modelo. Após arrefecimento até à TA, o andaime é fixada na sua nova forma temporária, que é mantida após a remoção do defeito. O comportamento de memória de forma de um …

Discussion

Este protocolo descreve a preparação de, uma estrutura de suporte com base em PCL revestidos por polydopamine cujo comportamento de auto-montagem, bem como osteoindutividade e bioactividade, faz com que seja de interesse para o tratamento de defeitos ósseos irregulares CMF. Aspectos do protocolo pode ser alterado para alterar várias características de andaime.

O protocolo começa com um acrylation de PCL-diol para permitir a cura por UV. No exemplo relatados, o PCL-diol H _{n é</sub…}

Materials

Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol)	Sigma-Aldrich	440752
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	D65100	Dried over 4A molecular sieves
4-dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma-Aldrich	D5640
Triethylamine (Et3N)	Sigma-Aldrich	T0886
Acryloyl chloride	Sigma-Aldrich	A24109
Ethyl Acetate	Sigma-Aldrich	319902
Potassium Carbonate (K2CO3)	Sigma-Aldrich	209619
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4)	Fisher	M65
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP)	Sigma-Aldrich	196118
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844
Dopamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	H8502
Tris buffer (2mol/L)	Fisher	BP1759	Used at 10 mM concentration, pH = 8.5
Sieve	VWR	47729-972
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W)	UVP	95-0426-02
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA)	TA Instruments	Q800
High Resolution Sputter Coater	Cressington	208HR
Scanning Electron Microscope (SEM)	FEI	Quanta 600