Ortotópico Implantación y Seguimiento de la célula inmune periférica en el modelo II-45 Singénico Rata Mesotelioma
Summary
Se presenta la generación de un modelo de rata ortotópico de mesotelioma maligno pleural mediante la implantación de II-45 células de mesotelioma en la cavidad pleural de ratas inmunocompetentes. Un método de citometría de flujo para analizar siete subconjuntos de células inmunes en estos animales de una muestra de sangre 25 l también se describe.
Abstract
El enorme aumento del interés en los tratamientos de base inmunológica para el cáncer, tales como vacunas e inhibidores de punto de control inmunológico, y un mayor entendimiento del papel del microentorno del tumor en la respuesta al tratamiento, en conjunto apuntan a la necesidad de modelos ortotópico inmuno-competentes para las pruebas preclínicas de estas nuevas terapias. En este trabajo se muestra cómo establecer un modelo de rata inmune competente ortotópico de mesotelioma maligno pleural. Progresión de la enfermedad de Monitoreo en modelos ortotópico es confundida por la ubicación interna de los tumores. Para supervisar longitudinalmente progresión de la enfermedad y su efecto sobre células inmunes circulantes en este y otros modelos de rata de cáncer, el flujo de un solo tubo ensayo de citometría de que requiere sólo 25 l de sangre completa se describe. Esto proporciona la cuantificación exacta de los siete parámetros inmunológicos: linfocitos totales, monocitos y neutrófilos, así como los subconjuntos de células T CD4 y CD8, células B y células asesinas naturales. Diferentes subsets de estos parámetros son útiles en diferentes circunstancias y modelos, con el neutrófilo a la proporción de linfocitos que tiene la mayor utilidad para el seguimiento de progresión de la enfermedad en el modelo de mesotelioma. Analizando los niveles circulantes de células inmunes que utilizan este método solo tubo también puede ayudar en el seguimiento de la respuesta a los tratamientos de base inmunológica y la comprensión de los mecanismos subyacentes que conducen al éxito o fracaso de un tratamiento.
Introduction
El mesotelioma maligno (MM) es una neoplasia agresiva que surge de las células transformadas en la membrana (mesotelio) que recubre el pulmón y la cavidad abdominal, el corazón y los órganos reproductivos internos, y es el tumor primario más frecuente de la cavidad pulmonar o la pleura 1,2 . La exposición a las fibras de amianto representa el 80% del total de MM, y si bien la prohibición de uso del amianto se introdujeron hace décadas en la mayoría de los países occidentales, su uso generalizado en la comunidad ha dejado un legado mortal. La Organización Mundial de la Salud ha estimado que 107.000 personas en el mundo mueren cada año por enfermedades relacionadas con el amianto, con tasas de mortalidad siguen aumentando. Una nueva ola de incidencia no ocupacional también está emergiendo y hay poca comprensión de cuándo, y en qué nivel esta llegará a su máximo 3.
La mayoría de las personas con MM son diagnosticados tarde cuando la quimioterapia sistémica representa una de las únicas opciones viables 4. Las mayoría de effective la quimioterapia y la corriente 'estándar de atención' (pemetrexed junto con cisplatino 5) fue identificado hace más de 10 años. Sin embargo el fracaso de este tratamiento es inevitable y no hay opciones de segunda línea probadas, dejando los pacientes con un pronóstico sombrío y la supervivencia media de sólo 12 meses 2. Por lo tanto, existe una necesidad no satisfecha urgente de tratamientos más eficaces. A pesar del examen de una serie de nuevos tratamientos en ensayos clínicos no se ha traducido en cambios en la práctica. Esto es debido en parte a la baja (5%) transferencia de resultados pre-clínicos, generalmente realizado en modelos de xenoinjerto de ratón, al ajuste de la clínica 6-8. Tales modelos no recapitulan fielmente los complejos aspectos de la microambiente tumoral se producen en lugares no fisiológicas, con frecuencia en la ausencia de un funcionamiento del sistema inmunológico 9.
Modelos ortotópico singeneicos crean un ambiente del tumor significativamente más realista que el commonly utilizado modelos de xenoinjerto subcutáneos como se producen los tumores en el lugar fisiológica correcta con un 10,11 intacta sistema inmunológico. El mayor tamaño de la rata aumenta su uso como modelo de la enfermedad de roedores, especialmente en los estudios de la droga donde la sangre dibuja serie se requieren para evaluar la respuesta al tratamiento y la toxicidad 12. Además, en modelos en los que el seguimiento de la progresión de la enfermedad es difícil debido a la ubicación de los tumores (como en la cavidad pleural), la capacidad de monitorear progresión de la enfermedad utilizando factores que se encuentran en la circulación es extremadamente atractivo. Se describe la generación de un modelo ortotópico singénico de mesotelioma pleural usando ratas inmuno-competentes. Además, también se describe un método fácil y relativamente no invasivo para el seguimiento de progresión de la enfermedad pleural mediante la medición de las células inmunes circulantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este documento detalla un método para la generación de un modelo ortotópico singénico de rata de mesotelioma pleural y un método simple para el seguimiento de la progresión de la enfermedad a través de muestreo de sangre longitudinal.
El modelo II-45 fue desarrollado mediante la exposición de ratas Fischer 344 a fibras de amianto 13. Aunque esta exposición representa la verdadera dinámica de las interacciones del sistema huésped-asbesto inmunológico para la patogénesi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.
Materials
| EDTA Collection tube (0.5ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount™ Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1mL Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur™ 4 colour | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail?. Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What’s wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats!. Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
