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Biologie

Mise en œuvre de patch clamp en direct et microscopie de fluorescence pour surveiller propriétés fonctionnelles des fraîchement isolés PKD épithélium

Published: September 01, 2015
doi:
10.3791/53035
, , , , ,
1Department of Physiology,Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology,University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

Les canaux ioniques exprimés dans l'épithélium tubulaire rénal jouent un rôle important dans la pathologie de la maladie polykystique des reins. Nous décrivons ici les protocoles expérimentaux utilisés pour effectuer l'analyse et le niveau de calcium intracellulaire mesures patch-clamp dans l'épithélium kystique fraîchement isolées à partir de reins de rongeurs.

Abstract

Cyst initiation et l'expansion au cours de la maladie polykystique des reins est un processus complexe caractérisé par des anomalies dans la prolifération des cellules tubulaire, l'accumulation de fluide luminal et formation de la matrice extracellulaire. L'activité des canaux ioniques et la signalisation intracellulaire de calcium sont des paramètres physiologiques clés qui déterminent les fonctions de l'épithélium tubulaire. Nous avons développé une méthode appropriée pour l'observation en temps réel de l'activité des canaux ioniques avec la technique de patch-clamp et l'enregistrement de Ca2 + intracellulaire niveau dans les monocouches épithéliales fraîchement isolés à partir de kystes rénaux. Rats PCK, un modèle génétique autosomique récessive de la maladie polykystique des reins (ARPKD), ont été utilisés ici pour l'analyse ex vivo de canaux ioniques et des flux de calcium. Décrit ici est une procédure étape par étape détaillé destiné à isoler monocouches kystiques et tubules non dilatée de PCK ou rats normaux Sprague Dawley (SD), et de surveiller l'activité de canal unique et dynamique intracellulaire de Ca2 +.Cette méthode ne nécessite pas de traitement enzymatique et permet une analyse dans un cadre natif de monocouche épithéliale fraîchement isolés. De plus, cette technique est très sensible aux variations de calcium intracellulaire et génère des images à haute résolution pour des mesures précises. Enfin, isolé épithélium kystique peut encore être utilisé pour la coloration avec des anticorps ou des colorants, la préparation des cultures primaires et la purification de différents dosages biochimiques.

Introduction

Les canaux ioniques jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques, y compris la croissance et la différenciation cellulaires. Les maladies rénales autosomiques dominants et récessifs polykystiques (PKRAD et PKRAR, respectivement) sont des troubles génétiques caractérisées par le développement de kystes remplis de fluide rénal de l'origine des cellules épithéliales tubulaires. PKD est causée par des mutations de gènes codant pour PKD1 ou PKD2 polycystines 1 et 2, des protéines membranaires impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et la différenciation. PKD2 par lui-même ou sous forme de complexe avec PKD1 fonctionnent également en tant que cation -permeable canal 1 de Ca2 +. Les mutations du gène codant fibrocystine PKHD1 (une protéine de type récepteur cils associés impliqués dans le tubulogenèse et / ou maintien de la polarité de l'épithélium) sont l'impulsion génétique de ARPKD 2. La croissance de kyste est un phénomène complexe accompagnée de la prolifération perturbée 3,4, 5 l'angiogenèse, la dédifférenciation et la perte de polairelité de cellules tubulaires 6-8.

Réabsorption défectueuse et la sécrétion augmentée dans l'épithélium kystique contribuent à l'accumulation de liquide dans la lumière et l'expansion kyste 9,10. Facultés dépendant du débit [Ca2 +] i la signalisation a été également liée à kystogenèse cours PKD 11-15.

Ici, nous décrivons une méthode appropriée pour la mesure de patch-clamp de l'activité de canal unique et les niveaux intracellulaires de Ca2 + dans des monocouches epitheliales kystiques isolés de rats PCK. Cette méthode a été appliquée avec succès par nous pour caractériser l'activité du canal Na + épithélial (ENAC) et 10 [Ca2 +] i dépendante processus induits par le Ca 2+ TRPV4 -permeable et purinergique cascade de signalisation 13.

Dans ces études, nous avons utilisé des rats PCK, un modèle de ARPKD causée par une mutation spontanée dans le gène PKHD1. La souche PCK était originallY provenant de rats 16 rats ainsi SD sont utilisés comme un contrôle approprié pour la comparaison avec la souche PCK Sprague-Dawley (SD). En conséquence, les deux segments de rats SD néphron et des conduits non dilaté collecte isolés à partir de rats PCK mêmes peuvent servir de deux groupes de comparaison différents pour des expériences sur l'épithélium kystique.

Protocol

Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité de soin et l'utilisation institutionnelle animale au Collège médical du Wisconsin et de l'Université du Health Science Center Texas à Houston et étaient en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. La figure 1 montre principales étapes de la séparation des tissus et la procédure de traitement. En bref, les reins des rats PCK…

Representative Results

Implication potentielle dans ENaC cystogénèse a été démontrée par de nombreuses études qui observe perturbé le facteur de croissance épidermique (EGF) de signalisation dans la progression PKD 22-25 et la réabsorption du sodium dans anormal ARPKD Les modèles murins et les cultures de tissus 26-28. Par exemple, Veizis et al. Ont montré que l'absorption de Na + sensible à l'amiloride est diminuée dans les cellules CD à partir du modèle de non-orthologue de s…

Discussion

Nous avons décrit ici applications de la technique de patch-clamp conventionnel et imagerie épifluorescence de calcium à des monocouches épithéliales kystiques dérivées d'un modèle génétique murine de ARPKD. Le protocole se compose de trois étapes, dont la plus grande attention devrait être accordée à l'isolement des kystes (étape 1.5 de la section des protocoles) et les études électrophysiologiques. Ces procédures clés nécessitent une formation approfondie et de patience, et le lecteur ne de…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) et Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) pour une excellente assistance technique avec des expériences de microscopie. Cette étude a été financée par les Instituts nationaux de la santé accorde R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (à OPO) et K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), l'American Heart Association 13GRNT16220002 (à OPO) et Ben Lipps J. bourse de recherche de l'American Society of Nephrology (DVI).

Materials

Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Flou-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich
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References

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Keywords: Patch ClampLive Fluorescence MicroscopyPolycystic Kidney DiseasePKDARPKDIon ChannelsCalcium SignalingEpithelial MonolayerEx Vivo AnalysisPCK RatSprague Dawley RatNative SettingEpithelial IsolationImmunostainingPrimary CultureBiochemical Assays
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Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).
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