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Biologie

Implementieren der Patch-Clamp und Live-Fluoreszenzmikroskopie, um funktionelle Eigenschaften von frisch isolierten PKD Epithel-Monitor

Published: September 01, 2015
doi:
10.3791/53035
, , , , ,
1Department of Physiology,Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology,University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

Ionenkanäle in renale tubuläre Epithel ausgedrückt spielen eine bedeutende Rolle in der Pathologie der polyzystischen Nierenerkrankung. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle verwendet, um Patch-Clamp-Analyse und intrazellulären Calcium-Pegelmessungen in Zystenepithel frisch aus Nagetier Nieren getrennt durchzuführen.

Abstract

Zysten Initiierung und Ausdehnung während polyzystische Nierenerkrankung ist ein komplexer Prozess, gekennzeichnet durch Abnormalitäten in Rohrzellproliferation, luminale Flüssigkeitsansammlung und die extrazelluläre Matrixbildung. Aktivität von Ionenkanälen und der intrazellulären Calcium-Signalgebung sind wichtige physiologische Parameter die Funktionen der Tubulusepithel bestimmen. Wir entwickelten ein für Echtzeit-Beobachtung von Ionenkanälen Aktivität mit Patch-Clamp-Technik, und die Registrierung der intrazellulären Ca 2+ Pegel in epithelialen Mono frisch aus Nierenzysten isoliert Methode. PCK-Ratten, ein genetisches Modell der autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD), wurden für die ex vivo Analyse der Ionenkanäle und Calciumfluss verwendet. Beschrieben wird hier eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren entwickelt, um zystische Monoschichten und nicht-dilatierten Tubuli von PCK oder normaler Sprague Dawley (SD) Ratten, zu isolieren und zu überwachen Einzelkanalaktivität und intrazelluläre Ca 2+ Dynamik.Dieses Verfahren erfordert keine enzymatische Verarbeitung und ermöglicht die Analyse in einer nativen Einstellung der frisch isolierten Epithelzellen-Monoschicht. Darüber hinaus ist diese Technik sehr empfindlich gegenüber intrazellulären Calciumänderungen und erzeugt Bilder mit hoher Auflösung für präzise Messungen. Schließlich kann isoliert Zystenepithel weiter zum Anfärben mit Antikörpern oder Farbstoffe, wurden primäre Kulturen und Reinigung für verschiedene biochemische Assays verwendet werden.

Introduction

Ionenkanäle spielen eine wichtige Rolle bei vielen physiologischen Funktionen, einschließlich Zellwachstum und Differenzierung. Autosomal dominante und rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD und ARPKD bezeichnet) sind genetische Störungen, die durch die Entwicklung von Nierenflüssigkeitsgefüllten Zysten des Rohr Epithelzelltumoren. ADPKD Mutationen von PKD1 oder PKD2 Gene Polyzystinen 1 und 2, Membranproteine ​​in der Regulation der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt kodiert verursacht. PKD2 allein oder als Komplex mit PKD1 fungieren auch als Ca 2+ durchlässige Kationenkanals 1. Mutationen des PKHD1 kodierende Gen Fibrocystin (a Zilien-assoziierten Rezeptor-ähnlichen Proteins in der Tubulogenese und / oder Wartung Polarität Epithel beteiligt sind) sind die genetischen Anstoß ARPKD 2. Zystenwachstum ist ein komplexes Phänomen mit gestörter Proliferation 3,4, Angiogenese 5, Dedifferenzierung und Verlust der polaren begleitetkeit von röhrenförmigen Zellen 6-8.

Defekten Reabsorption und Sekretion in Augmented Zystenepithel tragen zu einer Flüssigkeitsansammlung in dem Lumen und Zystenexpansions 9,10. Impaired strömungsabhängige [Ca 2+] i-Signalisierung wurde auch cystogenesis während PKD 11-15 verbunden.

Hier beschreiben wir eine für Patch-Clamp-Messungen von Einzelkanal-Aktivität und der intrazellulären Ca 2+ -Spiegel bei zystischer epithelialen Monoschichten von PCK Ratten isoliert Methode. Dieses Verfahren wurde von uns erfolgreich angewendet, um der Aktivität des epithelialen Na + -Kanal (ENaC) 10 charakterisieren und [Ca 2+] i -abhängigen Prozesse durch Ca 2+ durchlässige TRPV4 und purinergen Signalkaskade 13 induziert.

In diesen Studien verwendeten wir PCK Ratten ein Modell ARPKD durch eine spontane Mutation in dem PKHD1 Gen verursacht. Die PCK-Stamm war originally von Sprague-Dawley (SD) Ratten 16 dadurch SD-Ratten werden als eine geeignete Kontrolle zum Vergleich mit dem PCK verwendete Stamm abgeleitet ist. Als Ergebnis können beide SD-Ratte nephron Segmenten und nicht-erweiterten Sammelkanäle vom selben PCK Ratten isoliert, wie zwei unterschiedliche Vergleichsgruppen für Versuche zur Zystenepithel dienen.

Protocol

Die nachfolgend beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee am Medical College of Wisconsin und der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Figur 1 zeigt wesentliche Schritte des Gewebes Isolierung und Verarbeitungsverfahren. Kurz gesagt, werden Nieren von PCK oder SD-Ratten für die manuelle Isolier…

Representative Results

Potential ENaC Beteiligung cystogenesis durch mehrere Studien, die gestört epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) beobachtet Signalisierung in PKD Progression 22-25 und abnorme Natriumreabsorption in ARPKD Mausmodellen und Gewebekulturen 26-28 nachgewiesen. B. Veizis et al. Zeigten, dass Amilorid-sensitive Na + -Absorption in CD-Zellen aus dem nicht-ortho BPK Mausmodell ARPKD 29 verringert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass beeinträchtigte Natrium und Wasser Rückresorpt…

Discussion

Wir hier beschriebenen Anwendungen von herkömmlichen Patch-Clamp-Technik und Epifluoreszenz Calcium Imaging, um zystische Epithelzellen-Monoschichten aus einem Maus-Modell der genetischen ARPKD abgeleitet. Das Protokoll besteht aus drei Schritten, von denen die meisten Aufmerksamkeit ist auf die Isolierung der Zysten (Schritt 1.5 der Protokolle Abschnitt) und an die elektrophysiologische Studien bezahlt werden. Diese Schlüssel Verfahren erfordern umfangreiche Schulungen und Geduld, und der Leser sollte nicht enttäusc…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) und Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) für hervorragende technische Unterstützung bei der Mikroskopieexperimente bedanken. Diese Studie wurde von der National Institutes of Health gewährt R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (nach OPO) und K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (nach OPO) und der Ben J. Lipps-Forschungsstipendium von der American Society of Nephrology (auf DVI).

Materials

Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Flou-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich
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References

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

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Keywords: Patch ClampLive Fluorescence MicroscopyPolycystic Kidney DiseasePKDARPKDIon ChannelsCalcium SignalingEpithelial MonolayerEx Vivo AnalysisPCK RatSprague Dawley RatNative SettingEpithelial IsolationImmunostainingPrimary CultureBiochemical Assays
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Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).
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