पैच दबाना और लाइव प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को लागू हौसले से पृथक PKD उपकला के कार्यात्मक संपत्तियों को मॉनिटर करने के लिए
Summary
गुर्दे ट्यूबलर उपकला में व्यक्त आयन चैनल पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग की विकृति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहाँ हम हौसले कृंतक गुर्दे से अलग सिस्टिक उपकला में पैच दबाना विश्लेषण और intracellular कैल्शियम के स्तर का मापन का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है।
Abstract
पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग के दौरान पुटी दीक्षा और विस्तार ट्यूबलर सेल प्रसार, ल्यूमिनल तरल पदार्थ जमा और बाह्य मैट्रिक्स गठन में असामान्यताओं की विशेषता एक जटिल प्रक्रिया है। आयन चैनल और intracellular कैल्शियम सिगनल की गतिविधि ट्यूबलर उपकला के कार्यों को निर्धारित जो महत्वपूर्ण शारीरिक मापदंडों हैं। हम हौसले गुर्दे अल्सर से अलग उपकला monolayers में इंट्रासेल्युलर सीए 2 स्तर का पैच दबाना तकनीक और पंजीकरण के साथ आयन चैनल गतिविधि का वास्तविक समय अवलोकन के लिए उपयुक्त एक विधि विकसित की है। PCK चूहों, ऑटोसोमल रिसेसिव पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग (ARPKD) के एक आनुवंशिक मॉडल, आयन चैनलों और कैल्शियम प्रवाह के पूर्व vivo विश्लेषण के लिए यहां इस्तेमाल किया गया। यहाँ वर्णित एक चैनल गतिविधि और intracellular सीए 2 गतिशीलता सिस्टिक monolayers और PCK या सामान्य Sprague Dawley (एसडी) चूहों से गैर फैली हुई नलिकाओं को अलग, और निगरानी करने के लिए बनाया गया एक विस्तृत कदम-दर-कदम प्रक्रिया है।इस विधि एंजाइमी संसाधन की आवश्यकता होती है और हौसले से अलग उपकला monolayer के एक देशी सेटिंग में विश्लेषण की अनुमति देता नहीं है। इसके अलावा, इस तकनीक intracellular कैल्शियम परिवर्तन करने के लिए बहुत संवेदनशील है और सटीक मापन के लिए उच्च संकल्प छवियों उत्पन्न करता है। अंत में, अलग-थलग सिस्टिक उपकला आगे एंटीबॉडी या रंजक, विभिन्न जैव रासायनिक assays के लिए प्राथमिक संस्कृतियों की तैयारी और शुद्धि के साथ धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
आयन चैनल सेल के विकास और भेदभाव सहित कई शारीरिक कार्यों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। Autosomal प्रमुख और पीछे हटने का पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोगों (क्रमशः ADPKD और ARPKD,) ट्यूबलर उपकला कोशिका मूल के गुर्दे तरल पदार्थ से भरे अल्सर के विकास के द्वारा होती आनुवंशिक विकार हैं। ADPKD polycystins 1 और सेल प्रसार और भेदभाव के नियमन में शामिल 2, झिल्ली प्रोटीन एन्कोडिंग PKD1 या PKD2 जीन के म्यूटेशन के कारण होता है। स्वयं के द्वारा या PKD1 के साथ एक जटिल रूप PKD2 भी एक सीए 2 पारगम्य कटियन चैनल 1 के रूप में कार्य करते हैं। PKHD1 जीन एन्कोडिंग fibrocystin (tubulogenesis और / या उपकला के polarity के रखरखाव में शामिल एक सिलिया जुड़े रिसेप्टर की तरह प्रोटीन) के उत्परिवर्तन ARPKD 2 की आनुवंशिक प्रोत्साहन कर रहे हैं। पुटी विकास एक जटिल घटना से परेशान प्रसार 3,4, angiogenesis को 5, dedifferentiation और ध्रुवीय की हानि के साथ साथ हैट्यूबलर कोशिकाओं 6-8 की अल्पसंख्यक।
सिस्टिक उपकला में दोषपूर्ण पुनःअवशोषण और संवर्धित स्राव लुमेन और पुटी विस्तार 9,10 में तरल पदार्थ जमा करने के लिए योगदान करते हैं। बिगड़ा प्रवाह पर निर्भर [सीए 2 +] मैं सिगनल भी PKD 11-15 दौरान cystogenesis से जोड़ा गया है।
यहाँ, हम एक चैनल गतिविधि और PCK चूहों से अलग सिस्टिक उपकला monolayers में इंट्रासेल्युलर सीए 2 स्तरों के पैच दबाना माप के लिए उपयुक्त विधि का वर्णन है। इस पद्धति को सफलतापूर्वक उपकला ना + चैनल (ENaC) 10 की गतिविधि के लिए चिह्नित करने के लिए हमारे द्वारा लागू किया गया था और [सीए 2 +] मैं सीए 2 पारगम्य TRPV4 और purinergic संकेत झरना 13 से प्रेरित प्रक्रियाओं निर्भर।
इन अध्ययनों में हम PCK चूहों, PKHD1 जीन में एक सहज उत्परिवर्तन के कारण होता ARPKD के एक मॉडल का इस्तेमाल किया। PCK तनाव originall थाSprague-Dawley (एसडी) चूहों 16 जिससे एसडी चूहों PCK तनाव के साथ तुलना के लिए एक उचित नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं से निकाली गई वाई। नतीजतन, एक ही PCK चूहों से अलग एसडी चूहे नेफ्रॉन क्षेत्रों और गैर फैली हुई संग्रह नलिकाओं दोनों सिस्टिक उपकला पर प्रयोगों के लिए दो अलग अलग तुलना समूहों के रूप में सेवा कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम ARPKD की एक murine आनुवंशिक मॉडल से प्राप्त सिस्टिक उपकला monolayers के लिए यहां पारंपरिक पैच दबाना तकनीक और epifluorescence कैल्शियम इमेजिंग के आवेदनों का वर्णन किया। प्रोटोकॉल सबसे ज्यादा ध्यान अल्सर (प्रोटोकॉल खंड के ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के साथ उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए ग्लेन Slocum (विस्कॉन्सिन के मेडिकल कॉलेज) और कोलीन ए Lavin (Nikon उपकरण इंक) को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस अध्ययन (एएस) के लिए R01 HL108880, (OPO करने के लिए) R01 DK095029 और (टीएसपी) के लिए K99 HL116603, (टीएसपी) के लिए नेशनल किडनी फाउंडेशन IG1724, (OPO करने के लिए) अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 13GRNT16220002 और अनुदान के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया (डीवीआई करने के लिए) नेफ्रोलोजी के अमेरिकन सोसायटी की ओर से बेन जे Lipps रिसर्च फैलोशिप।
Materials
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Flou-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
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