Implementazione Patch Clamp e vivo microscopia a fluorescenza per il monitoraggio delle proprietà funzionali di recente isolato PKD Epithelium
Summary
Canali ionici espressi in renale tubulare svolgono un ruolo significativo nella patologia della malattia del rene policistico. Qui si descrive protocolli sperimentali utilizzati per eseguire patch-clamp analisi e di livello di calcio intracellulare misure in cistico appena isolato da reni di roditori.
Abstract
Cisti di iniziazione e di espansione durante la malattia del rene policistico è un processo complesso, caratterizzata da anomalie nella proliferazione delle cellule tubulari, accumulo di liquidi luminale e la formazione della matrice extracellulare. Attività di canali ionici e di segnalazione intracellulare di calcio sono parametri fisiologici fondamentali che determinano le funzioni di epitelio tubolare. Abbiamo sviluppato un metodo adatto per l'osservazione in tempo reale dell'attività canali ionici con la tecnica patch-clamp e registrazione di Ca2 + intracellulare in monostrati epiteliali livello appena isolate da cisti renali. Ratti PCK, un modello genetico di autosomica recessiva rene policistico (ARPKD), sono stati utilizzati qui per ex vivo l'analisi dei canali ionici e del flusso di calcio. Descritto qui è una procedura dettagliata passo-passo progettato per isolare monostrati cistica e tubuli non dilatata da PCK o normali Sprague Dawley (SD) ratti, e monitorare l'attività a canale singolo e intracellulari di Ca 2+ dinamiche.Questo metodo non richiede trattamento enzimatico e consente l'analisi in un ambiente nativo di fresco isolato monostrato epiteliale. Inoltre, questa tecnica è molto sensibile alle variazioni intracellulari di calcio e genera immagini ad alta risoluzione per misurazioni precise. Infine, isolato cistico può essere ulteriormente utilizzato per la colorazione con anticorpi o coloranti, preparazione di colture primarie e di purificazione per i vari saggi biochimici.
Introduction
Canali ionici svolgono un ruolo significativo in molte funzioni fisiologiche, tra cui la crescita cellulare e la differenziazione. Malattie autosomiche dominanti e recessivi policistiche renali (ADPKD e ARPKD, rispettivamente) sono malattie genetiche caratterizzate dallo sviluppo di cisti renali piene di liquido di origine tubulare delle cellule epiteliali. ADPKD è causata da mutazioni di PKD1 o PKD2 geni che codificano policistine 1 e 2, proteine di membrana coinvolte nella regolazione della proliferazione e differenziazione cellulare. PKD2 da solo o come un complesso con PKD1 funzionare anche come Ca 2+ canale cationico -permeable 1. Le mutazioni del gene che codifica PKHD1 fibrocistina (una proteina recettore simil-cilia associata coinvolte nella tubulogenesi e / o manutenzione di polarità di epitelio) sono l'impulso genetico di ARPKD 2. Crescita delle cisti è un fenomeno complesso accompagnato da proliferazione disturbato 3,4, angiogenesi 5, dedifferenziazione e la perdita di polarilità di cellule tubulari 6-8.
Riassorbimento difettoso e la secrezione aumentata in cistico contribuiscono all'accumulo di liquidi nel lume e cisti espansione 9,10. Flusso-dipendente alterata [Ca 2+] i segnalazione è stata anche legata alla cystogenesis durante PKD 11-15.
Qui, si descrive un metodo adatto per misure patch-clamp di attività singolo canale e intracellulari di Ca 2+ livelli in monostrati epiteliali cistiche isolati da ratti PCK. Questo metodo è stato applicato con successo da noi per caratterizzare l'attività del canale epiteliale Na + (ENaC) e 10 [Ca 2+] i indotti da processi -dipendente Ca 2+ TRPV4 -permeable e purinergica cascata di segnalazione 13.
In questi studi abbiamo utilizzato topi PCK, un modello di ARPKD causata da una mutazione spontanea nel gene PKHD1. Il ceppo PCK era originally derivate da ratti 16 ratti così SD sono utilizzati come controllo appropriato per il confronto con il ceppo Sprague-Dawley PCK (SD). Di conseguenza, entrambi i ratti nefrone SD e condotti non dilatato raccolta isolati da ratti stesso PCK possono servire come due diversi gruppi di confronto per esperimenti su cistico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto qui applicazioni della tradizionale tecnica del patch-clamp e di imaging epifluorescenza calcio per monostrati epiteliali cistica derivate da un modello genetico murino di ARPKD. Il protocollo consiste di tre fasi, di cui la più attenzione deve essere rivolta alla l'isolamento delle cisti (passo 1.5 della sezione di protocolli) e per gli studi elettrofisiologici. Queste procedure chiave richiedono una formazione completa e la pazienza, e il lettore non deve essere frustrato in una volta.
<p cl…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) per un'eccellente assistenza tecnica con esperimenti di microscopia. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (a OPO) e K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (a OPO) e Ben J. Lipps Research Fellowship dalla Società Americana di Nefrologia (DVI).
Materials
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Flou-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
| Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
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