Implementering Patch Clamp og Live Fluorescensmikroskopi til Monitor funksjonelle egenskaper nyisolerte PKD Epitel

Summary

Ionekanaler uttrykt i nyretubuli epitel spille en betydelig rolle i patologi polycystisk nyresykdom. Her beskriver vi eksperimentelle protokollene som brukes til å utføre patch-clamp analyse og intracellulær kalsium nivå målinger ved cystisk epitel fersk isolert fra gnager nyrer.

Abstract

Cyste initiering og ekspansjon i løpet av polycystisk nyresykdom er en kompleks prosess som kjennetegnes ved unormaliteter i rørformet celleproliferasjon, luminal væskeopphopning og ekstracellulær matrisedannelse. Aktivitet av ionekanaler og intracellulær kalsium signalisering er sentrale fysiologiske parametere som bestemmer funksjonene rørformet epitel. Vi utviklet en metode som passer for sanntids observasjon av ionekanaler aktivitet med patch-clamp teknikken og registrering av intracellulær Ca ²⁺ nivå i epitelmonolag nyisolerte fra nyrecyster. PCK rotter, en genetisk modell av autosomal recessiv polycystisk nyresykdom (ARPKD), ble brukt her for ex vivo analyse av ionekanaler og kalsium flux. Beskrevet her er en detaljert trinn-for-trinn fremgangsmåte er utformet for å isolere cystisk monolagene og ikke-utvidede rørelementer fra PCK eller normale Sprague Dawley (SD) rotter, og overvåke enkeltkanalaktivitet og intracellulære Ca ^{2 +} dynamikk.Denne metoden krever ikke enzymatisk behandling og lar analyse i en innfødt innstilling av nystekte isolert epitel enkeltlag. Dessuten er denne teknikk meget følsom for endringer i den intracellulære kalsium og genererer bilder med høy oppløsning for nøyaktige målinger. Endelig kan isoleres cystisk epitel videre brukes for farging med antistoffer eller fargestoffer, fremstillingen av primærkulturer og rensing av forskjellige biokjemiske analyser.

Introduction

Ionekanaler spille en betydelig rolle i mange fysiologiske funksjoner, inkludert cellevekst og differensiering. Autosomal dominant og recessive Polycystisk nyre sykdommer (ADPKD og ARPKD, henholdsvis) er genetiske lidelser preget av utviklingen av nyrevæskefylte cyster av røret epitelcelle opprinnelse. ADPKD er forårsaket av mutasjoner av PKD1 eller PKD2 gener som koder polycystins 1 og 2, membranproteiner som er involvert i regulering av celleproliferasjon og differensiering. PKD2 av seg selv eller som et kompleks med PKD1 også fungere som en ^Ca2 + -permeable kation kanal ^en. Mutasjoner i genet som koder for fibrocystin PKHD1 (a cilia-assosiert reseptor-lignende protein som er involvert i tubulogenesis og / eller vedlikehold av polariteten til epitel) er genetisk drivkraften i ARPKD ^2. Cyste veksten er et komplekst fenomen akkompagnert med forstyrret spredning ^3,4, angiogenese ^5, dedifferentiation og tap av polarligheten av rørformede celler ^6-8.

Defekt reabsorpsjon og utvidet sekresjon ved cystisk epitel bidra til væskeansamling i lumen og cyste utvidelse ^9,10. Nedsatt strømningsavhengige _^[Ca2 +] signalering er også knyttet til cystogenesis under PKD ^11-15.

Her beskriver vi en fremgangsmåte egnet for patch-clamp målinger av enkeltkanalaktivitet og intracellulære Ca ^{2 +} nivåer i pasienter med cystisk epitelmonolag isolert fra PCK rotter. Denne metoden ble anvendt med hell ved oss å karakterisere aktiviteten av epiteliale Na ⁺ kanal (ENaC) ¹⁰ og _^[Ca2 +] -avhengige prosesser som induseres av ^Ca 2 + -permeable TRPV4 og purinergiske signalkaskade ^13.

I disse studiene har vi brukt PCK rotter, en modell av ARPKD forårsaket av en spontan mutasjon i PKHD1 genet. Den PCK stammen var originally avledet fra Sprague-Dawley (SD) rotter som ¹⁶ derved SD-rotter blir anvendt som en egnet kontroll for sammenligning med PCK belastning. Som et resultat kan både SD rotte nevronet segmenter og ikke-utvidede oppsamlingskanaler isolert fra samme PCK rotter tjener som to forskjellige sammenligningsgrupper for eksperimenter med cystisk epitel.

Protocol

De eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet nedenfor ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Medical College of Wisconsin og University of Texas Health Science Center på Houston og var i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Figur 1 viser hovedtrinnene i vev isolasjon og prosesseringsprosedyre. Kort fortalt er nyrer fra PCK eller SD-rotter brukes til manuell isolering av epitelmonolag for innsamling kanaler enten fra friske ikke-slå…

Representative Results

Potensialet ENaC engasjement i cystogenesis har blitt demonstrert av flere studier som observerte forstyrret epidermal vekstfaktor (EGF) signale i PKD progresjon 22-25 og unormal natrium reabsorpsjon i ARPKD murine modeller og vevkulturer 26-28. For eksempel, Veizis et al., Viste at amilorid-sensitive Na + absorpsjon er nedsatt i CD-celler fra ikke-ortologe BPK musemodell for ARPKD 29. Vi har nylig vist at nedsatt natrium og vann reabsorpsjon i cyster er en viktig fak…

Discussion

Vi beskrev her anvendelser av konvensjonell patch-clamp teknikken og epifluorescence kalsium bildebehandling til cystisk epitelmonolag avledet fra en murine genetisk modell av ARPKD. Protokollen består av tre trinn, hvorav den mest oppmerksomhet bør rettes mot isolering av cyster (trinn 1.5 av protokoller delen) og til de elektrofysiologiske studier. Disse nøkkel prosedyrer krever omfattende opplæring og tålmodighet, og leseren bør ikke være frustrert på en gang.

Først av alt, bør …

Materials

Fura-2 AM	Life Technologies	F-14185
Flou-8	AAT Bioquest	21091
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Pluronic acid	Sigma-Aldrich	F-68	solution
Shaker	Boekel Scientific	260350
Light source	Sutter Instrument Co	Lambda XL	with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters	Nikon		ND4, ND8
Objective	Nikon	SFluo	40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera	Andor Technologies	Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted)	Nikon	Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass	Thermo Scientific	6661B52
Diamond pencil	Fisher Scientific	22268912
Image acquisition software	Nikon	Nikon NIS-Elements
Image analysis software	ImageJ	http://imagej.nih.gov/	ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-26
Patch Clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data Acquisition System	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Low Pass Filter	Warner Instruments	LPF-8	8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge	Narishige	MF-830	Japan
Motorized Micromanipulator	Sutter Instrument Co	MP-225
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Microvibration isolation table	TMC		equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system	AutoMake Scientific	Valve Bank II
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-26
Software	Molecular Devices	pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table	MCW core		for rodents
Binocular stereomicroscope	Nikon	SMZ745
Syringe pump-based perfusion system	Harvard Apparatus
polyethylene tubing	Sigma-Aldrich	PE50
Isofluorane anesthesia	http://www.vetequip.com/	911103
Other basic reagents	Sigma-Aldrich