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Biologie

Implementando Grampo patch e ao vivo microscopia de fluorescência para monitorar propriedades funcionais de recentemente isolados PKD Epithelium

Published: September 01, 2015
doi:
10.3791/53035
, , , , ,
1Department of Physiology,Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology,University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

Canais de iões expressas em epitélio tubular renal, desempenha um papel significativo na patologia da doença poliquística do rim. Aqui nós descrevemos protocolos experimentais utilizados para a realização de análises e medições de nível de cálcio intracelular de patch-clamp no epitélio cístico recentemente isoladas de rins de roedores.

Abstract

Iniciação cisto e expansão durante a doença renal policística é um processo complexo, caracterizado por anormalidades na proliferação celular tubular, acúmulo de líquido luminal e formação de matriz extracelular. Atividade de canais iônicos e sinalização intracelular de cálcio são parâmetros fisiológicos fundamentais que determinam funções do epitélio tubular. Foi desenvolvido um método adequado para observação em tempo real da actividade de canais de iões com a técnica de patch-clamp e registo de Ca2 + intracelular em monocamadas epiteliais nível isolados de fresco a partir de quistos renais. PCK ratos, um modelo genético de doença renal policística autossômica recessiva (DRPAR), foram usados ​​aqui para ex vivo análise de canais iônicos e fluxo de cálcio. Aqui descrito é um procedimento detalhado passo-a-passo projetado para isolar monocamadas cística e túbulos não dilatado de PCK ou ratos normais Sprague Dawley (SD), e monitorar a atividade de canal único e de Ca 2+ intracelular dinâmica.Este método não exige processamento enzimático e permite a análise de uma configuração nativa isolada de fresco de monocamada epitelial. Além disso, esta técnica é muito sensível a alterações de cálcio intracelular e gera imagens de alta resolução para medições precisas. Finalmente, isolado epitélio cística pode ser ainda utilizado para a coloração com anticorpos ou corantes, preparação de culturas primárias e purificação por vários ensaios bioquímicos.

Introduction

Canais de iões desempenhar um papel importante em muitas funções fisiológicas, incluindo crescimento e diferenciação celular. Doenças policística dominante autossómica recessiva e nos rins (ADPKD e ARPKD, respectivamente) são doenças genéticas caracterizadas pelo desenvolvimento de quistos renais cheios de fluido da origem nas células epiteliais tubulares. ADPKD é causada por mutações de genes PKD1 ou PKD2 codificam polycystins 1 e 2, proteínas de membrana envolvidas na regulação da proliferação e diferenciação celular. PKD2, por si só ou como um complexo com PKD1, também funcionar como um catião de Ca2 + -permeable canal 1. As mutações do gene que codifica PKHD1 fibrocystin (uma proteína do tipo receptor-associado cílios envolvidos na tubulogenesis e / ou manutenção da polaridade do epitélio) são o impulso genética da ARPKD 2. Crescimento do cisto é um fenômeno complexo, acompanhado de proliferação perturbado 3,4, angiogênese 5, desdiferenciação e perda de polardade de células tubulares 6-8.

Reabsorção defeituoso e secreção aumentada no epitélio cístico contribuir para o acúmulo de líquido no lúmen e cisto expansão 9,10. Fluxo-dependente prejudicada [Ca2 +] i sinalização também tem sido associada a cistogénese durante PKD 11-15.

Aqui, nós descrevemos um método adequado para medições de patch-clamp da actividade do canal único e níveis intracelulares de Ca 2+ em monocamadas epiteliais císticas isolados de ratos PCK. Este método foi aplicado com sucesso por nós para caracterizar de actividade do canal de Na + epitelial (ENaC) e 10 [Ca 2+] i induzidas por processos dependentes de Ca 2+ e TRPV4 -permeable purinérgico cascata de sinalização 13.

Nestes estudos utilizou-se ratos PCK, um modelo de ARPKD causada por uma mutação espontânea no gene PKHD1. A cepa PCK foi originally derivada a partir de ratos 16 ratos SD, assim, são utilizados como um controlo apropriado para comparação com a estirpe PCK Sprague-Dawley (SD). Como resultado, ambos os segmentos dos néfrons de ratos SD e dutos não dilatado coleta isolados de ratos mesmas PCK pode servir como dois grupos de comparação diferentes para fazer experimentos sobre epitélio cística.

Protocol

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional no Medical College of Wisconsin e University of Health Science Center Texas em Houston e estavam de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A Figura 1 demonstra os passos principais do processo de isolamento e processamento do tecido. Resumidamente, os rins de ratos SD ou PCK são utilizados para o isolamento manual das monocamadas e…

Representative Results

Potencial envolvimento ENaC em cistogénese tem sido demonstrada em vários estudos que observadas factor de crescimento epidérmico interrompido (FEG) de sinalização na progressão de PKD 22-25 e a reabsorção de sódio anormal na ARPKD modelos murinos e de culturas de tecidos 26-28. Por exemplo, Veizis et al. Mostraram que a absorção sensíveis ao amiloride Na + é diminuída em células CD a partir do modelo não-ortólogas rato BPK de ARPKD 29. Nós demonstra…

Discussion

Descrevemos aqui aplicações da técnica de patch-clamp convencional e imagiologia de epifluorescência cálcio para monocamadas epiteliais císticas derivados de um modelo murino de ARPKD genética. O protocolo consiste em três etapas, das quais a maior atenção deve ser dada ao isolamento dos cistos (passo 1.5 da seção de protocolos) e aos estudos eletrofisiológicos. Estes procedimentos fundamentais requerem treinamento extenso e paciência, eo leitor não deve ser frustrado ao mesmo tempo.

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Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) para assistência técnica excelente, com experimentos de microscopia. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 HL108880 (a AS), R01 DK095029 (para OPO) e K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (para OPO) e o Ben J. Lipps Research Fellowship da Sociedade Americana de Nefrologia (para DVI).

Materials

Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Flou-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich
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References

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Keywords: Patch ClampLive Fluorescence MicroscopyPolycystic Kidney DiseasePKDARPKDIon ChannelsCalcium SignalingEpithelial MonolayerEx Vivo AnalysisPCK RatSprague Dawley RatNative SettingEpithelial IsolationImmunostainingPrimary CultureBiochemical Assays
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Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).
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