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Biologie

La implementación de Patch Clamp y vivo microscopía de fluorescencia para supervisar propiedades funcionales de recién aisladas PKD Epitelio

Published: September 01, 2015
doi:
10.3791/53035
, , , , ,
1Department of Physiology,Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology,University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

Los canales iónicos expresadas en el epitelio tubular renal desempeñan un papel importante en la patología de la enfermedad poliquística del riñón. Aquí se describen los protocolos experimentales utilizados para realizar mediciones de análisis y el nivel de calcio intracelular patch-clamp en el epitelio quística recién aisladas de los riñones de roedores.

Abstract

Iniciación quiste y expansión durante la enfermedad renal poliquística es un proceso complejo caracterizado por anormalidades en la proliferación celular tubular, acumulación de líquido luminal y la formación de matriz extracelular. La actividad de los canales iónicos y la señalización de calcio intracelular son parámetros fisiológicos clave que determinan las funciones de epitelio tubular. Hemos desarrollado un método adecuado para la observación en tiempo real de la actividad de los canales iónicos con la técnica de patch-clamp y el registro de nivel intracelular de Ca2 + en monocapas epiteliales recién aisladas de quistes renales. PCK ratas, un modelo genético de la enfermedad poliquística autosómica recesiva del riñón (ARPKD), se utilizaron aquí para el análisis ex vivo de los canales iónicos y el flujo de calcio. Descrito aquí es un procedimiento detallado paso a paso diseñado para aislar monocapas quísticas y túbulos no dilatado de PCK o ratas normales Sprague Dawley (SD), y supervisar la actividad de un solo canal e intracelulares de Ca 2+ dinámica.Este método no requiere procesamiento enzimático y permite el análisis en un entorno nativo de recién aisladas monocapa epitelial. Además, esta técnica es muy sensible a los cambios de calcio intracelular y genera imágenes de alta resolución para mediciones precisas. Por último, aislado epitelio quístico se puede utilizar más de tinción con anticuerpos o colorantes, preparación de cultivos primarios y purificación de diversos ensayos bioquímicos.

Introduction

Los canales iónicos juegan un papel importante en muchas funciones fisiológicas, incluyendo el crecimiento y la diferenciación celular. Enfermedades renales autosómicos dominantes y recesivos poliquísticos (PQRAD y ARPKD, respectivamente) son trastornos genéticos caracterizados por el desarrollo de quistes llenos de líquido renales de origen de las células epiteliales tubulares. PQRAD está causada por mutaciones de los genes PKD1 o PKD2 codifican poliquistinas 1 y 2, las proteínas de membrana que participan en la regulación de la proliferación y diferenciación celular. PKD2 por sí mismo o como un complejo con PKD1 también funcionan como un canal catiónico -permeable Ca 2 + 1. Las mutaciones del gen que codifica PKHD1 fibrocystin (una proteína similar al receptor de los cilios asociada a involucrados en el tubulogenesis y / o mantenimiento de la polaridad del epitelio) son el impulso genético de ARPKD 2. Crecimiento quiste es un fenómeno complejo acompañada con la proliferación perturbado 3,4, la angiogénesis 5, la desdiferenciación y pérdida de polardad de las células tubulares 6-8.

Reabsorción defectuosa y secreción aumentada en el epitelio quístico contribuyen a la acumulación de líquido en el lumen y el quiste de expansión 9,10. Flujo dependiente Deterioro [Ca 2 +] i de señalización también se ha vinculado a la quistogénesis durante PKD 11-15.

Aquí se describe un método adecuado para mediciones de patch-clamp de la actividad de un solo canal e intracelulares de Ca 2+ niveles en monocapas epiteliales quísticas aisladas de ratas PCK. Este método fue aplicado con éxito por nosotros para caracterizar la actividad del canal epitelial de Na + (ENAC) 10 y la [Ca2 +] i dependiente de procesos inducidos por Ca2 + TRPV4 -permeable y la cascada de señalización purinérgico 13.

En estos estudios se utilizaron ratas PCK, un modelo de ARPKD causada por una mutación espontánea en el gen PKHD1. La cepa PCK fue originally derivados de las ratas 16 ratas de ese modo SD se utilizan como un control apropiado para la comparación con la cepa Sprague-Dawley PCK (SD). Como resultado, ambos segmentos de la nefrona de ratas SD y conductos no dilatado recogida aisladas de ratas PCK mismos pueden servir como dos grupos de comparación diferentes para experimentos en el epitelio quística.

Protocol

Los procedimientos experimentales se describen a continuación fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Colegio Médico de Wisconsin y la Universidad de Texas Health Science Center en Houston y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La Figura 1 demuestra principales etapas del aislamiento de tejido y procedimiento de procesamiento. En pocas palabras, los riñones de ratas PCK o SD se uti…

Representative Results

Participación ENaC potencial en quistogénesis ha sido demostrado por varios estudios que observan factor de crecimiento epidérmico perturbado (FEAG) de señalización en PKD progresión de 22-25 y la reabsorción de sodio anormal en ARPKD modelos murinos y cultivos de tejidos 26-28. Por ejemplo, Veizis et al. Mostraron que la absorción sensible a amilorida Na + se reduce en las células de CD desde el modelo de ratón BPK no ortólogos de ARPKD 29. Recientemente h…

Discussion

Describimos aquí las aplicaciones de la técnica de patch-clamp convencional y imágenes de calcio epifluorescencia a monocapas epiteliales quísticas derivadas de un modelo genético murino de ARPKD. El protocolo consiste en tres pasos, de los cuales se debe prestar la mayor atención al aislamiento de los quistes (paso 1.5 de la sección de protocolos) y para los estudios electrofisiológicos. Estos procedimientos clave requieren una amplia formación y la paciencia, y el lector no debe ser frustrada a la vez.

<p…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Glen Slocum (Colegio Médico de Wisconsin) y Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) para una excelente asistencia técnica con los experimentos de microscopía. Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud otorga R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (OPO) y K99 HL116603 (con TSP), la Fundación Nacional del Riñón IG1724 (con TSP), Asociación Americana del Corazón 13GRNT16220002 (OPO) y Ben J. Lipps de Becas de Investigación de la Sociedad Americana de Nefrología (DVI).

Materials

Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Flou-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich
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Keywords: Patch ClampLive Fluorescence MicroscopyPolycystic Kidney DiseasePKDARPKDIon ChannelsCalcium SignalingEpithelial MonolayerEx Vivo AnalysisPCK RatSprague Dawley RatNative SettingEpithelial IsolationImmunostainingPrimary CultureBiochemical Assays
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Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).
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