JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Implementera Patch Clamp och Live fluorescensmikroskopi att övervaka funktionella egenskaper hos nyisolerade PKD epitel

Published: September 01, 2015
doi:
10.3791/53035
, , , , ,
1Department of Physiology,Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology,University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

Jonkanaler uttrycks i tubulär epitel spelar en viktig roll i patologin av polycystisk njursjukdom. Här beskriver vi experimentella protokoll som används för att utföra patch-clamp analys och intracellulär kalcium nivå mätningar i cystisk epitel nyisolerade från gnagare njurar.

Abstract

Cysta initiering och expansion under polycystisk njursjukdom är en komplex process som kännetecknas av avvikelser i tubulär celltillväxt, luminal vätskeansamling och extracellulär matrisbildning. Aktivitet av jonkanaler och intracellulärt kalcium signalering är viktiga fysiologiska parametrar som bestämmer funktioner av tubulärt epitel. Vi utvecklade en metod som lämpar sig för realtidsobservation av jonkanaler aktivitet med patch-clamp-tekniken och registrering av intracellulär Ca2 + nivå i epiteliala monoskikt nyisolerade från njurcystor. PCK råttor, en genetisk modell för autosomal recessiv polycystisk njursjukdom (ARPKD), användes här för ex vivo analys av jonkanaler och kalciumflöde. Beskrivs här är en detaljerad steg-för-steg förfarande för att isolera cystisk monolager och icke-vidgade tubuli från PCK eller normala Sprague Dawley (SD) råttor, och övervaka enda kanal aktivitet och intracellulära Ca2 + dynamik.Den här metoden kräver inte enzymatisk bearbetning och möjliggör analys i en infödd miljö av nyligen isolerade epitelial monolager. Dessutom är denna teknik mycket känslig för intracellulära kalciumförändringar och genererar bilder med hög upplösning för exakta mätningar. Slutligen kan isolerade cystisk epitel användas vidare för färgning med antikroppar eller färgämnen, beredning av primärkulturer och rening av olika biokemiska analyser.

Introduction

Jonkanaler spelar en viktig roll i många fysiologiska funktioner, inklusive celltillväxt och differentiering. Autosomalt dominant och recessiva polycystiska njursjukdomar (ADPKD och ARPKD, respektive) är genetiska sjukdomar som kännetecknas av utveckling av njurvätskefyllda cystor av den rörformiga epitelceller ursprung. ADPKD orsakas av mutationer i PKD1 eller PKD2 gener som kodar polycystins 1 och 2, membranproteiner är involverade i regleringen av celltillväxt och differentiering. PKD2 i sig eller som ett komplex med PKD1 fungerar också som en Ca2 + -permeable ning kanal 1. Mutationer av PKHD1 genen som kodar fibrocystin (en cilier associerad receptorliknande protein involverat i tubulogenesis och / eller underhåll av polariteten hos epitel) är den genetiska impulser av ARPKD 2. Cysta tillväxt ett komplext fenomen tillsammans med störd spridning 3,4, angiogenes 5, dedifferentiering och förlust av poläraten av tubulära celler 6-8.

Defekt reabsorption och förstärkt sekretion i cystisk epitel bidra till vätskeansamling i lumen och cysta expansions 9,10. Nedsatt flödesberoende [Ca2 +] i signaleringen har också kopplat till cystogenesis under PKD 11-15.

Här beskriver vi ett förfarande som är lämpligt för patch-clamp mätningar av enstaka kanalaktivitet och intracellulära Ca2 + nivåer i cystisk epiteliala monoskikt isolerade från PCK råttor. Denna metod har framgångsrikt tillämpats av oss för att karakterisera aktiviteten hos epitelial Na * kanal (ENAC) 10 och [Ca2 +] i -beroende processer som induceras av Ca2 + -permeable TRPV4 och Purinergic signaleringskaskad 13.

I dessa studier använde vi PCK råttor, en modell av ARPKD orsakas av en spontan mutation i PKHD1 genen. Den PCK-stammen var originally härrörande från Sprague-Dawley (SD) råttor 16 därigenom SD-råttor används som en lämplig kontroll för jämförelse med PCK stammen. Som ett resultat kan både SD råtta nephron segment och icke-dilaterade samlingsrör isolerade från samma PCK-råttor tjänar som två olika jämförelsegrupper för experiment på cystisk epitel.

Protocol

De experimentella förfaranden som beskrivs nedan godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Medical College of Wisconsin och University of Texas Health Science Center i Houston och var i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Figur 1 visar huvudstegen i vävnads isolering och förfarande för förädling. I korthet njurar från PCK eller SD-råttor som används för manuell isolering av epitelceller monolager att saml…

Representative Results

Potentiell ENAC inblandning i cystogenesis har påvisats genom flera studier som observerade sönder epidermal tillväxtfaktor (EGF) signalering i PKD progression 22-25 och onormal natrium reabsorption i ARPKD musmodeller och vävnadskulturer 26-28. Till exempel, Veizis et al. Visade att amilorid känsliga Na + absorption minskas i CD-celler från icke-ortologa BPK musmodell för ARPKD 29. Vi visade nyligen att nedsatt natrium och vatten reabsorption i cystor är en v…

Discussion

Vi beskrivs här tillämpningar av konventionell patch-clamp teknik och epifluorescence kalcium avbildning till cystisk epiteliala monolager som härrör från en mus genetisk modell av ARPKD. Protokollet består av tre steg, varav mest uppmärksamhet bör ägnas åt isoleringen av cystor (steg 1,5 avsnitt protokollen) och de elektrofysiologiska studier. Dessa viktiga förfaranden kräver omfattande utbildning och tålamod, och läsaren ska inte vara frustrerad på en gång.

Först och främ…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) och Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) för utmärkt tekniskt bistånd med mikroskopi experiment. Denna studie stöddes av National Institutes of Health bidrag R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (till OPO) och K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (till OPO) och Ben J. Lipps forskartjänst från American Society of Nephrology (DVI).

Materials

Fura-2 AM Life Technologies F-14185
Flou-8 AAT Bioquest 21091
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Shaker Boekel Scientific 260350
Light source Sutter Instrument Co Lambda XL with integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filters Nikon ND4, ND8
Objective Nikon SFluo  40/1.3 DIC WD 0.22   oil
Camera Andor Technologies Zyla sCMOS
Nikon  microscope (inverted) Nikon Nikon Eclipse TE2000-S
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
Diamond pencil Fisher Scientific 22268912
Image acquisition software Nikon Nikon NIS-Elements 
Image analysis software ImageJ http://imagej.nih.gov/ ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Binocular stereomicroscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

Tags

Keywords: Patch ClampLive Fluorescence MicroscopyPolycystic Kidney DiseasePKDARPKDIon ChannelsCalcium SignalingEpithelial MonolayerEx Vivo AnalysisPCK RatSprague Dawley RatNative SettingEpithelial IsolationImmunostainingPrimary CultureBiochemical Assays
check_url/fr/53035?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J. Vis. Exp. (103), e53035, doi:10.3791/53035 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image