Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.
Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).
מחקרים של ספיגה במעיים של שומן, ותרופות מסיסים בשומנים וויטמינים יכולים להתנהל in vivo על ידי שימוש במודל פיסטולה הלימפה 1 – 4. עם זאת, הטכניקות הניתוחיות המעורבים הן לא רק אתגר, אבל גם יקרות. למרות in vivo גישות המבוסס על ניתוח צואה עשויה להיות מנוצלת, הם משמשים בעיקר כדי לקבוע את ספיגת אחוזים על ידי מערכת עיכול 2,5. המודל במבחנה המתואר במאמר זה הוא יותר חסכוני, והטכניקות מעורבות הן ללא ספק פחות מאתגרות. מחקרי הנדסה גנטיים הם גם חסכוניים יותר ופחות כאשר הם נערכו באמצעות מודל במבחנה זה זמן רב.
מאז חומרי שומנים מסיסים הנלקחים על ידי enterocytes ארוזים ליפופרוטאינים 6,7, את האפקטיביות של מודל זה במבחנה כדי לייצר ליפופרוטאינים היא קריטיות. Intestina שתי העיקריליפופרוטאינים l הם chylomicrons ומאוד ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (VLDL). Chylomicrons, מוגדר כיפופרוטאינים עם 80 ננומטר או יותר בקוטר, מיוצר אך ורק על ידי המעי הדק כאשר שומנים הם בשפע נוכחי בלומן במערכת העיכול. מאז הם יפופרוטאינים הגדולים, chylomicrons הם להעלות על הדעת מובילי שומנים יעילים ביותר. מודל זה במבחנה, שהוא מסוגל לייצר chylomicrons 8, יכול לשמש כדי לחקור קליטה תזונתית שומן, ספיגת ויטמין מסיס בשומנים על ידי המעיים, וזמינות ביולוגית תרופה אוראלית lipophilic. הנוכחות של מולקולות שומנים מסיסים, ויטמינים, או סמים בשבריר ליפופרוטאין היא אינדיקטור של קליטתם על ידי המעי הדק. כפי שנאמר קודם לכן, מודל זה יכול לשמש כדי לשפר את הזמינות הביולוגית תרופה אוראלית lipophilic 6.
מאמר זה מתאר כיצד יש לשמור על קאקו-2 תאים בקרום חדיר או מנות בתרבית רקמה רגילות, איך מיל השומניםxture לגירוי ייצור ליפופרוטאין צריך להיות מוכן, איך מערכת ביטוי lentivirus יכולה להיות מועסקות על מנת להשיג ביטוי יתר יעיל, וכיצד יש לנתח יפופרוטאינים המבודדים.
במאמר זה, שתי מערכות שיכולים לשמש כדי לשמור קאקו-2 תאים מתוארים, כלומר, צלחת תרבית רקמה הרגילה וקרום החדיר. היתרונות של שימוש במערכת הקרום החדיר כוללים הפרדה של הפסגה ותאי basolateral, ואת יכולת דגירה תערובת השומנים ולאסוף את ההפרשה ליפופרוטאין בו זמנית. עם זאת, מוסיף קרום ה…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Seed Grant Award from California Northstate University College of Pharmacy (to AMN). The authors would like to thank California Northstate University College of Pharmacy for covering the publication cost of this article, and George Talbott for his help in editing this manuscript.
DMEM | VWR | 16750-112 | Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells |
FBS | Fisher | 3600511 | We do not heat inactivate our serum |
Trypsin | VWR | 45000-660 | Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment |
Permeable membrane system | Fisher | 7200173 | 10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane |
10 cm dish | Fisher | 08-772-E | Tissue culture dish |
15 cm dish | Fisher | 08-772-24 | Tissue culture dish |
24 well plate | Fisher | 12565163 | Tissue culture plate |
Lipid-based transfection reagent | Fisher | PRE2691 | Can be substituted with other transfection reagent |
Reduced serum media | Invitrogen | 11058021 | For transfection |
pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
Bottle-top filter | Fisher | 9761120 | 0.45 mm pore |
Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/mL |
Oleic acid | Sigma | 01383-5G | Prevent freeze-thaw cycle |
Lecithin | Fisher | IC10214625 | Egg lecithin |
Sodium taurocholate | Fisher | NC9620276 | Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956 |
Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free) | Fisher | 5892791001 | Used mainly for samples that need TEM analysis |
Polycarbonate ultracentrifuge tube | Fisher | NC9696153 | Reusing it multiple times will collapse the tube |
Lid for ultracentrifuge tube | Fisher | NC9796914 | A tool is required to remove the tube/lid from rotor |
Syringe | Fisher | 50-949-261 | Disposable |
Syringe filter | Fisher | 09-719C | Pore size = 0.2 mm; nylon |
Phosphotungstic acid | Fisher | AC208310250 | For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0 |
Tweezer | Fisher | 50-238-62 | Extra fine and strong tips |
Formvar/carbon grid | Fisher | 50-260-34 | Formvar/carbon film square grid 400 Copper |