Summary
新規モデルにおける共病的なアルツハイマー病(AD)とストロークの状態を調べるために、3つの動作タスクは、モータ制御および認知行動の両方を評価することに記載されています。これらのタスクは、ビーム歩行タスク、シリンダータスクとモリス水迷路を含みます。
Abstract
アルツハイマー病(AD)は、神経変性および記憶喪失を生じる衰弱性の神経変性疾患です。年齢は、ADの主要な危険因子ですが、ストロークも危険因子と増悪因子として関与しています。脳卒中およびAD悪化脳卒中関連のモータ制御をもたらし、AD関連認知障害の併存疾患単独の各条件と比較した場合。脳卒中およびADを組み合わせた状態をモデル化するために、ADの新規なトランスジェニックラットモデルは、そのDNAに組み込まれたアミロイド前駆体タンパク質(ADの発症に関与する重要なタンパク質)の変異形で、小片側線条体のストロークが与えられます。
ストロークとADの両方を組み合わせたモデルでは、脳卒中に関連するモータ制御、歩行およびAD関連認知機能を評価する行動テストを実装する必要があります。シリンダータスクが自発前肢モータの使用を評価する、コスト効率の高い、多目的装置を含み、。このタスクでは、ラットを、ラットが自発的にリア意志円筒形装置、内に置かれ、その前肢とシリンダの壁に接触します。これらの接点は、前肢モータ使用とみなされ、試験後のビデオ分析の際に定量化されています。実装され、別のコスト効率の高いモータータスクは、前肢のコントロールを評価するビームウォークタスク、後肢の制御と運動です。このタスクは、前肢のスリップ、後肢スリップや落下の分析を通じて四肢モータ制御の評価を可能に木製の梁を横断ラットの歩行を伴います。学習と記憶の評価は、この行動パラダイムのためのモリス水迷路で完成されています。プロトコルは、ラットが静止隠されたプラットフォームの位置を特定することにより空間学習、で始まります。空間学習後、プラットフォームを除去し、短期および長期の空間参照記憶の両方が評価されます。これらのタスクのすべての3つは、このパラを作り、行動の違いに敏感で、このモデルのために28日以内に完了していますdigm時間効率とコスト効率の高いです。
Introduction
アルツハイマー病(AD)は、高齢者人口における認知症および衰弱性神経変性疾患の最も一般的な形態です。病理組織学的に、ADは、アミロイド斑、神経原線維変化およびニューロン損失としてそれ自身を示します。アミロイド斑は、βセクレターゼおよびγセクレターゼ酵素1,2,3によるアミロイド前駆体タンパク質(APP)の改変されたタンパク質分解切断を経て製造されたβ-アミロイドペプチド(Aβ)で主に構成されています。切断産物は、Aβは、脳内の堆積物は、病的なアミロイド斑を作成し、特性学習障害と記憶喪失につながる可能性が脳に毒性作用を有しています。これらの工程の全ては、一緒に「アミロイドカスケード仮説」3,4と呼ばれます。 ADを調査する際、この仮説は重要であるが、他の細胞の変化は、元のアミロイドカスケード経路から外れるこれらのプラーク形成に先行することが見出されています。これらの他細胞の変化は、減損前プラーク形成3,5,6にADに関与する他の認知機能障害、学習初期の記憶喪失に貢献すると考えられています。
ADは、ますます一般的になってでは、ADを発症する危険因子は、研究の非常に重要な焦点になってきています。年齢はADの散発的形態のための主要な危険因子であるが、他の危険因子は、脳卒中7,8を含む、同定されています。脳卒中は危険因子であるだけでなく、それはまた、既に存在する認知症を悪化させることができます。例えば、臨床的に、ADの進行は、以前に脳卒中9を経験した患者に悪いことが示されています。また、増加したAPP発現とAβの蓄積が誘導されたストローク10,11と組み合わせたAβ毒性の実験動物モデルにおいて見出されています。ストロークとADの間のこの重要な相互作用があるので、これら二つの病理をさらに調査することが必須です一緒に併発モデルでより良い両方の条件に関与病態生理や行動を理解します。
共同病的条件を調査するために、適切なモデルとは、ストロークがAD様病理を生成するためにAβと相互作用することができる開発する必要がありました。最初に、そのDNAに組み込まれた変異したヒトAPP遺伝子を有するAPP21トランスジェニックラットは、ADの適切なモデルを実現するために使用されました。変異は、両方のAD 4,8,12の家族型に関与しているスウェーデンの二重ミスセンスおよびインディアナ単一のミスセンス変異です。追加の侮辱が存在しない場合には、このラットモデルの年齢特性Aβ斑や神経原線維変化12を開発することなく。したがって、AD様行動の病態を誘導するための努力で、小さなストロークが認知症患者9中にしばしば存在する小さな皮質下のストロークを模倣するために、右線条体中に導入されます。 APP21トランスジェニックraのストロークtは合併条件を体現し、両方の疾患状態に関与する行動の変化の様々な種類の調査を可能にします。具体的には、成体ラットにおけるAD様病理および認知障害のこの誘導は、私たちは、ADの前最古の分子と認知変化を調査することができます。
目標が併存モデルを検討する際のストロークとADの両方が、非常に明確な行動病理を持っているので、行動の変化の最初の兆候を決定することですので、行動のタスクは、行動の表現型の多様性を評価する必要があります。パラダイムや機器の様々な関与齧歯類モデルでモーターと認知行動を分析するために行うことができ、比較的敏感な一連の試験があります。具体的に前肢と後肢の運動機能を分析するために、シリンダータスクとビーム徒歩タスクは、運動障害を検出し、このモデルで運動を監視するために実施されてきました。特に細かいFOを評価するために設計された他の敏感なタスクrelimbモータースキル( すなわち階段タスクと単一ペレット到達タスク)絶食11,13,14が必要です。疾患の病理15,16,17上の絶食の既知の効果のいずれかを回避するために、これらのテストは、この研究には適さないとみなされてきました。シリンダータスクは、新しい環境で飼育中のラットの前肢の自発的な使用を評価し、一方的なストローク10,18とラットで前肢間の非対称性を検出することができます。このタスクの主な利点は、装置は、ポルソルト強制水泳タスク19などの他の動作タスクのために利用できることです。シリンダータスクに反して、ビームウォークタスクはまた、10,14を locmotionに加えて、後肢および前肢モータ制御の分析を可能にします。ビーム歩行運動部品、バランス成分および熟練した足の配置が含まれています。これらの試験の両方は、コスト効率の高い、簡単で、時間効率的であり、D上のストロークとADの影響を解明します四肢の機能でifferences。
別に運動機能の変化から、ADの疾患進行の早い段階で提示することができる記憶障害を含みます。齧歯類モデルにおけるAD様の病状に対処するとき、海馬が重要な脳の構造が大きくAD 2に影響があるため、海馬依存学習と記憶が評価されることが重要です。海馬は、齧歯類の様々な迷路パラダイムを用いて試験することができる空間学習および記憶と、その機能のために必須の脳領域です。異なる疾患のげっ歯類モデルの大部分は広く使用されている迷路タスクの1つは、モリス水迷路20です。モリス水迷路は、静止隠されたプラットフォームの位置を、ラットを支援する空間キューを利用し、プラットフォームが除去されると、空間参照記憶をテストします。水迷路セットアップの貴重な利点は、提案された研究の質問20に応じて高度に適応可能であるということです。
10トンは ">初めて、記載された技術は、脳卒中およびADの新規併存ラットモデルにおいて、モータと認知機能を評価するために使用されてきた。APP21トランスジェニックラットモデルで小さなストロークを含む。共同罹患率を誘導することによって達成されました線条体における血管の血管収縮がAPP21トランスジェニックラットの小さなストロークを生成する。この脳卒中モデルはよくAD 11の代替ラットモデルにおける共病的状態として確立されている。進歩をAPP21トランスジェニックラットモデルが意図されていたこの小説に行動タスクが併存ストロークとADのラットモデルを使用して説明されるが、より翻訳貴重なモデルを生成するために、これらのタスクは、さらに他の脳卒中のモデルまたは他の神経疾患のモデル( すなわち 、パーキンソン病)。一般的に適用することができます記載された方法は、これらの他の疾患状態に広く適用されますが、行動のタイムラインとパラダイムが提案されている解像度に基づいて、変更を必要とするかもしれませんearchが質問とモデル。また、コストおよび時間効率的でありながら適応であることに加えて、説明されているタスクは、軽微な障害を示すのに有効です。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
適切な制度上の動物の倫理委員会は、実験前に開始する行動手順のすべてを承認する必要があります。ここで説明するすべての動物作業はウエスタンユニバーシティ動物使用分科会によって承認され、動物実験ガイドラインにカナダの評議会を次のされました。これらの動物実験は、光フェーズ中に行われました。
総前肢モーター評価のための1シリンダータスク
- 機器のセットアップ
- 実験に用いたラットのサイズに対応しますあき蓋付きのプレキシガラス筒を取得します。シリンダーの大きさは、飼育時ラットがトップに到達することを可能にするべきではない、それが壁とラットの鼻やラットの尾の付け根の間に2センチメートルを可能にすべきです。シリンダーの標準サイズは直径23センチ、6ヶ月齢(400〜600グラム)のラットのための高さは40 cmです。
- シリンダーがPLEに座ってシリンダ装置下の45°の角度でミラーを配置xiglasは30cm程度のテーブルトップの上に立ったりサポートのいくつかの他の形。
- ビデオカメラのミラーに円筒の直径全体を可視化するために適切な距離に三脚にビデオカメラを設定します。
- 調光器の設定に照明を回して、突然大きな音の影響を低減するために部屋の中にホワイトノイズ( すなわち低容量、微妙な音楽)を再生。これは、運動を奨励し、原因で大きな音に凍結を防ぐのを助けるべきです。
- 実験手順
- 音楽演奏や調光器照明で部屋にラットを順応さ最初の試験の開始前に実験室の30分にラットを移動します。
- 小さ なホワイトボードに対応する動物と裁判情報(動物番号、タイムラインやトライアル数日)を書きます。鏡の前でこのボードを置きます。
- 鏡の前でホワイトボードを持つビデオカメラのプレスレコード、ベースOの近くにラットを拾います尾fは、シリンダ内にラットを置き、ふたを固定します。ビデオ録画との干渉を避けるために、シリンダの側にオフに立っています。
- 鏡の前からホワイトボードを取り外して、ビデオカメラの記録を5分間シリンダ内のラットを(ホワイトボードが削除されたときから5分を記録するためにタイマーを使用)してみましょう。これは、1つの試験です。
- 試用後に紙タオルと水でシリンダーを清掃してください。
- 繰り返しは3回の試験の合計を達成するために、1.2.2-1.2.5さらに2回繰り返します。シリンダーへの慣れの機会を減少させる20-30分の試行間の時間があるはずです。この間、他のラットのためのシリンダ試験を実行します。
- ビデオ分析
- ビデオ編集プログラムにインポートするビデオカメラのファイル( すなわち、iMovieの)
- 各試験のためのクリップにビデオをコンパイルします。ビデオの音量をミュートし、元の25%にビデオの速度を低下させます。
- 前肢の連絡先の数を数えます左右の前肢用シリンダの壁と。同時に左右の連絡先については、「両方」として、これらの前肢の連絡先を数えます。ビデオはビデオで左前肢が、現実には、動物の右前肢に相当すると思われるものをミラーを介して記録されていることに留意してください。
- 以下の式を用いて(ストロークに反対側の)影響を受けた前肢のパーセント使用を計算します。[{/総数コンタクト(連絡先+½二国間の接点に影響を与えた)}×100]。野生型群とストロークせず、トランスジェニック群の両方の性能は、疾患誘発性の問題の提示を評価するために、比較グループとみなされます。
2.梁徒歩タスク粗大運動評価のための
- 機器のセットアップ
- 2cm幅と約120センチで、滑らかな密封された木製の梁(200〜600グラムのラットのための最適な幅)を取得します。
- 2つのテーブルを置くか、アンシェルビング離れて、その100センチメートル。各ユニットの表面は、地上約40 cmである必要があります。
- テーブルまたはテープを用いて表面をシェルビング梁の両端を固定します。約1メートル、サポートされていないビーム長のは今地上40センチメートルを上昇させる必要があります。
- 梁の全長をキャプチャ、スタンドにビデオカメラを設定します。映像のコントラストを高めるために、白のラットを使用した場合、ビームの後ろに黒い背景を導入することを検討してください。
- 実験手順
- 音楽演奏や調光器照明で部屋にラットを順応さ最初の試験の開始前に実験室の30分にラットを移動します。
- ビームの一端に、ラットのホームケージや環境エンリッチメント管を配置し、ビームの他端にラットを配置します。
- 実証実験の2日前に少数の非記録ランを行っています。ラットが地域を探索してみましょうし、ラットのベースを保持することによって、ビームに向けてラットを導きますしっぽ。
- ラットがビームを横切った後、ビームとリピートの他端にケージやチューブを移動します。ラットはどちらの方向にも自由にビームを横切ると、トレーニングセッションが終わりました。すべての動物の間で一貫性のあるトレーニングランの数を保管してください。
- 小さ なホワイトボードに対応する動物と裁判情報(動物番号、タイムラインやトライアル数日)を書きます。ビームの後ろの壁にこのホワイトボードをテープで固定します。
- ビームの一端に、ラットのホームケージまたは環境濃縮チューブを置きます。
- 押してビデオカメラで記録し、ホームケージやチューブへのビーム反対側の端部にテールと場所のベースによってラットを拾います。
- ラットが正常に上昇した梁の全長を横断完了したときに終了裁判、全体を記録します。ラットの一時停止は、尾の付け根により穏やかラット首筋、ビームを横切って途中やそっとラットの尾に触れた場合ビームを横切る動きを促進します。どのような方法で前方にラットを押さないでください。
- 再実行梁に、繰り返し歩い停止または一貫性のない歩きながらラットは横を向いトライアルを。ラットが低下し、静かに、ビームにハングアップラットをすくい上げると秋の位置に梁の上に戻って配置し、裁判を継続し続ける場合。
- 、ビームの他端にホームケージやチューブを移動するホワイトボードにトライアル#を変更し、その後の裁判を記録。
- 6試験の合計が完了するまで3試験は各方向のために記録されていると、この手順を繰り返します。ラットのためのすべての6試験は、次のラットについて臨床試験を開始する前に記録することができます。
- ビデオ分析
- ビデオ編集プログラム( すなわち iMovieの)にインポートするビデオカメラのファイル。
- 各試験のためにクリップにビデオをコンパイルして、ビデオの音量をミュート。フレームによって、各ビデオクリップのフレームを分析します。
- 数を数えます総ステップのラットは、梁の全長と左右の後肢と前肢のスリップや転倒の合計数の合計数を歩くのにかかります。ストロークなしの両方の野生型グループとトランスジェニックグループの業績は、共病的状態に固有の赤字の出現を評価するために合併群と比較して考えられています。
海馬依存の空間学習およびリファレンスメモリ3.モリス水迷路
- 機器のセットアップ
- 円形プール(148センチメートル直径58センチの深さ)の中央部の上方に位置するビデオカメラを固定します。追跡ソフトウェアプログラムでプールの概要と正しく4指定の象限を合わせます。
- 約36センチメートル深層水の円形プールを入力します。水は数日前に実験プロトコルを開始するプールを充填することにより、室温に温めなければなりません。
- 黒の非毒性のアクリル塗料アンを追加白いラットを用いたときに水ゴマ不透明です。暗い色のついたラットのために、白色として、光色を使用してください。
- 必要に応じて部屋のディバイダーを含む空白の壁面とプールを囲みます。ときにプールに、ラットは、実験者を見ることができないようにしてください。
- ポスターボードの異なる色から4大異なる形状の空間キューをカットし、指定された北、東、南東と南西プールの場所ごとに壁に1形状を添付してください。これらの手がかりは、プールの縁よりもわずかに高くする必要があります。
- 試験中に予想外の大きな音に気を取らされるのラットを防ぐために、北西象限に低音量でラジオをオンにします。
- ターゲット象限の中央に円形のプラットフォーム(11.5センチメートル直径、2〜3センチメートル水位以下の面)を配置します。
- メインルームライトをオフにして、領域を照明するためにプールに部屋分周器の反対側のフロアスタンディングランプをオンにします。
- コンピューター構成
- モリス水迷路行動タスク用に設計されており、実験前を開始するプロトコルを設定されている追跡プログラムを使用してください。可能なプログラムの例を図4に設けられています。
- 空間学習実験のために90秒ずつの4件の試験で4日間連続を設定します。
- 最後の空間学習試験と第一のプローブ実験後の1週間後24時間で30秒ずつの2つの別々のプローブ実験を設定します。
- セットは、第2のプローブ実験後24時間を開始する2日間連続して1日4裁判で裁判を学ぶきっかけと。各試験は60秒の合計でなければなりません。
- 任意の与えられた動物のための各試行間の20分の試行間間隔があるように、各段階について、テストの順序を設定します。他の動物は限りすべての動物が20分試行間間隔を維持するように、この試行間間隔の間に実行することができます。
- プラットフォームの位置は、実験者によって定義されるべきであることを確認し、他のすべてのゾーンが解除されていること指定されたプラットフォームの位置によって罰金を科さ。
- 各試行を手動で開始および終了するプログラムを設定します。
- 南西の象限に円形プラットフォームを置きます。これは、コンピュータのプログラム上の象限における円形指定された「プラットフォーム」エリアに位置合わせする必要があります。
- プールの周り開始位置は、各ラットについて無作為化されるべきです。各処置群内のすべての開始位置を表しています。いいえラットは、プローブ試験中の小説の開始位置を可能にするために提示パラダイム内の任意の空間学習試験のための北東の位置から開始しません。
- その尾の基部にラットを持って、静かに指定された開始位置にプールの壁に沿って水の中に置き、すぐにラットの視界の外に移動します。
- 他の実験者は、すぐにラットが水の中にあるようにトラッキングソフトウェアを起動しています。タイマーは、追跡プログラムに0からカウントアップを開始する必要があります。 ラットがプラットフォームを見つけた場合、他の実験者がコンピュータ上で裁判を停止し、それを取得する前に、少なくとも30秒間プラットフォームにラットを残しています。裁判は、コンピュータ上で停止される前に、ラットがプラットフォームをオフにジャンプした場合、裁判は継続されます。
- ラットが割り当てられた試行時間でプラットフォームを見つけられない場合、あなたの手が(どちらかのラットがあなたの手に従うか、その尾の付け根によって、ラットを導く作る)を使用して、プラットフォームにラットを導きます。 30秒のためのプラットフォームにラットを保持します。
- タオルで覆い、ラットは、ポータブル表面上に登るせされ、実験者の腕の上に、その尾の付け根によってプールからラットを削除します。
- ラット当たり4試行の合計手順を繰り返し3.3.3-3.3.7。各ラットのための20分の試行間間隔があるはずです。
- ラットの最終的な空間学習トライアル後少なくとも10分間加熱ランプの下で彼らのホームケージにラットを返します。
- エクサを続けます空間学習の日〜4日の2のためのct同じ空間学習プロトコル。
- 日2-4で、もはやプラットフォーム上でラットを保持していません。ラットが視界の外に実験者と30秒間の支援なしプラットフォームの上に座ることを可能にします。これは機会に1日目の後に試験中に行うことができます。
- プールからプラットフォームを削除してください。以前のプラットフォームの位置を確認すると、コンピュータ(南西象限の円)で定義されたままです。
- 北東の位置にプールの壁に沿って水の中にラットを置き、すぐにラットの視界の外に移動します。小説の使用は北東位置はラットが以前に訓練された開始位置から独立したプラットフォームの位置をリコールすることを確実に開始します。
- 他の実験者は、すぐにラットが水の中にあるようにトラッキングソフトウェアを起動しています。タイマーは、トラッキングソフトウェアで0からカウントアップを開始する必要があります。
- からラットを取得南西その尾の付け根によるプールの象限とは、タオルで覆われた腕で保持またはラットポータブル表面上に登りましょう。
- 各ラットのプローブ試行後少なくとも10分間加熱ランプの下で彼らのホームケージにラットを返します。
- 1週間後(3.4.1-3.4.5ステップ)この実験を繰り返します。
- プラットフォーム8.5センチでスタンドに直径4cm白い球状のキューを確保するためにテープを使用します(キューの総高さ12.5センチ)。球状のキューの先頭には、少なくとも8.5センチメートル水位より上になります。
- プールを囲む壁から空間キューを削除してください。
- プラットフォームの位置をランダム化し、各グループの各ラットについてポジションを開始します。すべてのプラットフォームと開始位置は、各処置群について表現されるべきです。
- 指定されたプラットフォーム領域にプラットフォームを置き、トラッキングソフトウェアで定義します。
- tでのプールの壁に沿って水の中にラットを置きます彼は、ラットの視界の外に移動素早く位置を開始し、指定されました。
- 他の実験者は、すぐにラットが水の中にあるようにトラッキングソフトウェアを起動しています。タイマーは、トラッキングソフトウェアで0からカウントアップを開始する必要があります。
- ラットがプラットフォームに到達すると、他の実験者は、コンピュータ上の裁判を停止しています。ラットがプラットフォームをオフにジャンプした場合、裁判は継続されます。ラットを取得する前に、ラットは15秒間のプラットフォームの上に座ることができます。
- その尾の付け根によってプールからラットを取得し、タオルで覆われた腕で保持またはラットポータブル表面上に登りましょう。
- 次のラットのためのプラットフォームの位置を確認し、トラッキングソフトウェアで定義されている対応する領域にプラットフォームを移動します。
- 以下の3試験のための手順を繰り返し3.5.4-3.5.9。 15分の試行間間隔があるはずです。
- 各ラットのFINA後少なくとも10分間加熱ランプの下で彼らのホームケージにラットを返しますlは裁判を学ぶきっかけと。
- きっかけと学習の2日目のために同じプロトコルを続けます。
注:ゾーンに旅行したゾーンで過ごした時間、距離、平均速度、ゾーンへの最初のエントリにゾーンと時間へのエントリ数は、しばしば使用されます。
- プラットフォームゾーンと空間の一日あたりの平均速度に達するまでの時間と距離を分析し、個別に学習手掛かり。プローブ実験のために、生の時間またはプローブ2のプローブ1からのパーセント変化としてターゲットゾーンへの最初のエントリに待ち時間を分析します。
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Representative Results
記載行動タスクは、アルツハイマー病のAPP21トランスジェニックラットモデルにおける脳卒中の効果を実証するために使用されました。ストロークとAPP21導入遺伝子の組み合わせは、影響を受けた手足の大きな運動障害、ならびに増加した記憶障害をもたらすことが期待されます。
シリンダータスクは総前肢の運動機能を評価し、影響を受けた前肢の使用のように表されます。また、ビームウォークタスクは、特に後肢運動機能および運動を評価しました。ストロークが右線条体に誘導されたので、左前肢を1が存在する場合、運動障害を示すことが期待されます。 図2と図3aおよび3bの両方に示されたデータは、統計的にその併存ラットを示すものではありませんそれぞれ、前肢や後肢の赤字を持っています。これらの動物は、APがいない間、前肢や後肢運動障害を持っている梨、彼らは運動に関連する運動機能に若干の違いを持っているように見えます。ビーム徒歩でタスクの合計ステップが大幅ビームウォークタスクは歩行や運動の小さな変化をピックアップするのに十分な感度であることを示唆し、脳卒中(P <0.05、 図3c)との共同病的なトランスジェニックラットで増加しました。使用される小型の線条体脳卒中モデルは、すべての主要な運動障害を生成するには小さすぎる可能性がある小さなストロークを生成するが、赤字は、これら二つのタスク10,14と他のストロークモデルで以前に実証されています。提示されたパラメータを調査する際にここで、これらのタスクは、単に運動機能および運動を監視することができます。
海馬依存性の空間学習と参照メモリを効果的にモリス水迷路を用いて評価することができます。グループ間での学習には明らかな違い( 図5aはありませんでした >、 図5b)、したがって、学習の違いは、メモリのパフォーマンスの違いを考慮することはできません。ストロークでAPP21トランスジェニックラットは、卒中た(p <0.05、 図5c)でストロークと野生型ラットなしトランスジェニックラットに比べて強固な長期的参照記憶障害を実証しました。
手掛かり学習はラットがモリス水迷路でプラットフォームを見つけるために視覚的な空間キューを使用する同等の能力を持っていることを確実にするために完成されています。 図6a及び図6bに示されるように、差は群間手がかり学習時にプラットフォームに到達するように遅延や経路長で観察されませんでした。また、平均水泳速度が( 図6c)グループ間の一致したと能力を脱出し、泳ぐ動機はグループ間で同等であったことを示しています。
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図1: モーターと認知行動評価のためのタイムライン脳卒中誘導手術の日が割り当てられ、0日目、すべてのテストの日はこの日を参考にしています。 (A)シリンダータスク(C)とビーム歩行タスク(BM)のための手術前と手術後のテスト。 (B)モリス水迷路空間学習、プローブテストと学習手掛かり。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2:罹患前肢のシリンダタスクパーセント用いるステップ1.3.4での式を用いて計算し、3日目のベースライン値に標準化しました。赤い点線は、それぞれの同じ使用を表す1.0の値に注釈を付けますシリンダータスクで前肢。野生型はWTと略記され、トランスジェニックは、TGと略記されます。動物番号は以下の通り:WT +生理食塩水(N = 7)、WT +ストローク(N = 8)、TG +生理食塩水(N = 8)、TG +ストローク(N = 6)。すべての値は平均±SEMとして提示されています。 (双方向ANOVA、Tukeyの事後)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3: ビームウォークタスクは 5試験全体の(A)で作られたすべての伝票の合計影響を受けると(B)影響を受けていない後肢は、ビームを横断するために取られるステップの合計数の割合として提示されます。 - 手術前比術後の比の値は次のようにベースライン値に標準化しました。ビームOを横断する(C)の総ステップ nは日-7および21日目の野生型はWTと略記され、トランスジェニックは、TGと略記されます。動物番号は以下の通り:WT +生理食塩水(N = 6)、WT +ストローク(N = 6)、TG +生理食塩水(N = 6)、TG +ストローク(N = 5)。すべての値が±SEMとアスタリスクは統計的有意性を示す意味として提示されています。 (一方向ANOVA、Tukeyの事後に、p <0.05)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4:プログラムビューセットアップに必要なセクションを実証し、実験を実行しているいくつかは、モリス水迷路に使用する追跡プログラムの特徴を強調しました。提示されたときに[テスト]タブで上記の機能を備えたプールの映像と装置ビューにのみ表示されます。3089fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5:モリス水迷路における空間学習および参照メモリは、空間学習は、プラットフォームに到達するために(A)待ち時間及び(B)光路長で測定しました。 (C)参照メモリは12日目のプローブ検査に比べて19日目のプローブ検査上のターゲットゾーンへの最初のエントリへのレイテンシのパーセント変化として測定しました。野生型はWTと略記され、トランスジェニックは、TGと略記されます。動物番号は以下の通り:WT +生理食塩水(N = 8)、WT +ストローク(N = 7)、TG +生理食塩水(N = 7)、TG +ストローク(N = 8)。すべての値が±SEMとアスタリスクは統計的有意性を示す意味として提示されています。 (空間学習と一方向ANOVAプローブテストのために、Tukeyの事後、P&ための双方向ANOVA#60; 0.05) 、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6:頭出しモリス水迷路における学習 (A)レイテンシと(B)経路長プラットフォームに到達するためには、学習の全8回の平均値として記載されています。 (C)水泳速度は学習の全8回の平均値として提示されています。野生型はWTと略記され、トランスジェニックは、TGと略記されます。動物番号は以下の通り:WT +生理食塩水(N = 8)、WT +ストローク(N = 7)、TG +生理食塩水(N = 7)、TG +ストローク(N = 8)。値は平均±SEMとして提示されています。 (一方向ANOVA、Tukeyの事後)。 このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。
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Discussion
モータと各状態の重症度に応じて、認知機能の両方に影響を与える可能性が非常に明確な行動病理における脳卒中およびアルツハイマー病の結果の組み合わせ。従って、これらの状態の個々の寄与を決定するだけでなく、共病的状態に合わせて、潜在的に相互作用効果にいくつかの洞察を与えるために行動様々なタスクを利用することが必要です。提示されたデータは、脳卒中を有する新規併存APP21トランスジェニックラットモデルにおいて運動機能と海馬依存空間学習および参照記憶を評価するために、3つのコスト効率の高い、時間効率と敏感な行動タスクを示しています。提示されたデータに加えて、これらのタスクは10,14,18と同様に、AD 8,16のモデルでより深刻なストロークモデルで検証されており、両疾患の様々なモデルに広く適用可能であるべきです。
言われていることを、何のタスクは、Liなしではありませんmitations。ラットは、シリンダと、ビームに慣れになった場合、モータの作業については具体的には、いくつかのトラブルシューティングが必要になることがあります。シリンダタスクでは、動機は、ラットがシリンダの壁と前肢接触の適切な量を達成確保するために必要とされ得ます。この結果を達成するために、シリンダーの穴あき蓋や壁に非毒性の香りの適用は、背面にラットを動機付けし、その前肢とシリンダの壁に接触することができます。例えば、ピーナッツバターやバニラエッセンスを少しはさらに、シリンダー壁を探索するために坐ったラットを奨励するためにシリンダーの上部に近い内壁に塗布することができます。着色されたテープのリングはまた、シリンダの底部から円筒3/4の内側に塗布することができます。育成を促進する別の方法は、座りがちなラットを除去し、プロトコルにおける試行間間隔で実現されているいくつかの時間が経過した後にシリンダに再導入することを含みます。毛皮thermore、裁判の途中であき蓋を取り外し、ラットの長さに比べて、シリンダの高さに応じて飼育し、シリンダ壁との前肢の接触促すことができます。ラットは試験中にシリンダから脱出することができるようになります可能性がある場合、これは行うべきではありません。これらの動機は、後部の数を増やすに役立つかもしれないが、壁の接触の際に左右の前肢の使用に影響を与えるべきではありません。これらの提案を実施した後の前肢の連絡の不十分な数について大きな懸念がまだある場合は、ラットにかかわらず、時間の長さの10後部の合計をした後、試験を終了することができます。各ラットは、異なる時間に10後部の合計に到達するように、これは、上記のプロトコルで完了する5分の試験は異なるであろう。脳卒中およびAD併存疾患のモデルでは、認知能力、不安と活動レベルの変化は、これらのラットに発症し得ることを認識することが重要です。 Whileこのような変化は、直接開発することが非運動関連の行動変化のための貴重な証拠を構成することができる他の観察を記録し、(飼育中に自発的な前肢の使用)シリンダータスクの主要な結果には影響しません。飼育はやる気探索行動の一形態であるように、シリンダのタスクでは、このような行動は、潜在的に、増加または行動を飼育減少し分析することによって観察することができます。また、時間などの他の手段は、それぞれ、不安や他の物理的障害に関する洞察を提供することができ回すと着陸、グルーミング過ごしました。
ホームケージ濃縮管を用いて、ビームウォークタスクに関して、通常ラットはビームを歩いて渡るするための十分な動機です。ラットは、このようなピーナッツバターや精密砂糖ペレットとして、ビームの途中に、香り高い食品の報酬を停止したり、治療を継続した場合、反対側の端部に濃縮管に加えて導入することができます。扱いが与えられた場合、すべてのラットは、ABを受けていることを確認試験日に扱い、同じ量のうち、彼らのパフォーマンスに依存しません。さらに、むしろ次のラットに移動する前に、ラットのための6つのすべての試験を実行するよりも、試験が互い違いに配置することができました。例えば、最初の2つの試験は、次の2を開始する前に、すべてのラットで完了することができました。これは、途中でいくつかのラットはビーム環境とあまりにも快適になったときに、後で裁判に発生する可能性があり、ビームを横切って停止数の増加を防ぐことができます。頻繁な停止が発生した場合、別の可能な解決策は、試行回数を減少させることです。これにより試行回数を減らすことができるように、各試行の左右両方の肢を分析するために、ビームの背後にミラーを配置することによって実現することができます。また、ビームに馴化は、複数のテストセッションの後に発生する可能性があると動物をやる気にさせるためのすべての努力にもかかわらず、ビームを横切るように、ビームに座ったまま拒否ラットをもたらすことができます。この問題のため、ビーム評価はLOで繰り返しテストのための理想的ではありませんngの長期実験。反復試験を利用するプロトコルでは、補償もモチベーションに加えて、心配になることができます。ビームを横断しながら、補償の問題を克服するために、テーパー状の ビームは、通常の木製の梁21のではなく、使用することができます。
再び、増加不安および全体的な活動レベルの変化やモチベーションを含む認知の変化は、この動物モデルで行うことができます。したがって、ビームを横断しながら、ビームならびにそれらの速度と非運動行動(、停止座って、震え、向き)を横断する動物の動機に関する実験群の間で任意の凹凸のメモを取ることが重要です。
行動アルツハイマー病研究は、モリス水迷路を使用して、ここで達成された短期および長期記憶の試験を必要とします。多くのプロトコルは、空間学習後24時間は、長期記憶21であると考えますが、このプロトコルでと空間学習後の24時間のimelineは短期記憶とみなされ、1週間は、長期記憶と考えられています。プローブ試験の間に、この1週間の期間中、ラットはモリス水迷路空間参照メモリとの干渉を避けるために、他の行動のタスクまたは不必要なストレス要因にさらされるべきではありません。
空間学習に関しては、実験者は、一定時間ジャンプすることなく、プラットフォームの上に座るためにラットを必要とする中で、永続的でなければなりません。ラットが正常にプラットフォームに座っているが、オフにジャンプした場合の実験者が視界に入って来るように、ラットは、配置されるか、またはプラットフォームに戻って導かれ、実験者は、動物を取得するまでのプラットフォームの上に座るために必要とされるべきです。水泳ながら水を脱出する唯一の方法として、プラットフォームの学習を強制するために、ラットは、プローブ試行の設定でない限り、ピックアップされるべきではありません。ラットはプールのリムにプラットフォームからジャンプする管理している場合、platforを移動することを検討して脱出の代替経路の学習を阻止するために、プールの中心に向かってさらにメートル。
空間的および手掛かり学習中の空間的なバイアスがないことを確認するには、治療群における各ラットの開始位置と頭出しプラットフォームの位置がランダム化されるべきです。各処置群は空間学習のための各開始位置から開始または手掛かり学習のための同じ開始とプラットフォームの位置パラダイムを以下のラットの代表的な数を持っている必要があります。開始位置を割り当てるため、Vorheesとウィリアムズは、空間学習及び手掛かりが20を学習するための無作為化開始とプラットフォームの位置のための無作為化開始位置の非常に詳細なセットを提示します。これは、最初モリス水迷路試験の前に、各ラットに位置を割り当てるために直接またはガイドラインとして使用することができます。
モリス水迷路データの分析のために、上記のプロトコルでの提案はここに提示されたデータが取得された方法を表します。ダットモリス水迷路上記プロトコルのステップ3.6に収集認知障害を記述するのに有用であり得る様々なアウトカム指標を計算するために使用することができます。たとえば、数値データセットを超えて、追跡ソフトウェアは、実験者に動物の検索戦略に追加の洞察を与えることができるトラックプロットを、分析する機会を提供しています。さらに、すべての象限に関連する標的四分円内に移動した時間の割合または距離は、プローブ試験における参照記憶の尺度として使用することができます。これらの共病的な動物モデルは、いくつかの運動障害を示すことができることを心に留めておくことが重要です。実験群の間で泳ぐ速度を比較すると、潜在的な運動障害は、モリス水迷路で実行するための動物の能力に影響を与えているかどうかの指示を与えることができます。また、水迷路結果における交絡因子となってからモータ性能を除外するためには、プラットフォームに到達するためにパスの長さを見てお勧めします待ち時間に加えて、 図5及び6に示されたようにスピードを泳ぎます。水泳能力が何らかの方法で損なわれている場合、パスの長さは、海馬の機能を評価するための最も正確な測定値です。
説明これらの行動のすべてのタスクに適用することができ、様々な異なるタイムラインがありますが、各実験の実行方法は同じである必要があります。ここに示されたデータは、脳卒中や脳内のAβ代謝との潜在的相互作用後の早いイベントをキャプチャ21日脳卒中後の回復の時点で達成されました。ここで提示されたデータは、脳卒中およびアルツハイマー病の併存モデルであったが、これらのタスクはに適用したり、様々な研究課題やモデルに合うように適合させることができます。シリンダーテストはあまり変更標準的な手順ですが、ビームウォークタスクがやや適切なビームWIDTを選択することによって期待される運動障害の重症度に調整することができますHS。水迷路は、本明細書で言及した全てのパラダイムの中で最も汎用性のテストです。例えば、アクイジション・フェーズの終わりと空間参照メモリプローブ試行の間の様々な間隔を選択することが容易に短期および長期のメモリをテストすることができます。メモリ戦略シフト作動、実行機能の二つの成分は、また、水迷路のセットアップを使用して試験することができます。作業記憶を評価するために、試行間間隔は、新しいプラットフォームの位置を取得する学習時に1分未満に低減することができます。また、動物は最初のプラットフォームの場所の取得に成功した後に、プラットフォームの第二の、新しい場所を学ぶ有する精神的柔軟性や戦略シフトをテストすることができます。これらの潜在的な変更のすべてを考慮すると、前述のすべての利点に加えて、もう一つの大きな利点であるこれらの行動タスクと柔軟性の多くは、そこにあります。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cylinder | Western University | Plexiglas Cylinder Cylinder Diameter: 23 cm Cylinder Height: 40 cm Platform Height: 30 cm Mirror Length: 35 cm Mirror Width: 26.5 cm |
This was made specifically by Western University Machine Services for our lab. Please contact your own chosen manufacturer to design this product. |
Handheld Video Camera | JVC | GZ-E200 | |
Video Camera Tripod | Slik | F163 | |
AM/FM Clock Radio | Sylvania | SCR1388 | |
White Board | Walmart | Width: 71.12 cm Height: 55.88 cm |
These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
Dry-erase Marker | Expo | Expo Dry-erase Original Marker | These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
Wooden Beam | Rona | Plywood Width: 2 cm Length: 100 cm |
|
VWR General Purpose Laboratory Tape | VWR Intl. | 89097-920 | |
iMovie '11 | Apple Inc. | Version 9.0.9 (1795) | This is the version used in this manuscript, but any other iMovie version or video editing software could be used. |
Morris Water Maze Pool with Platform | Stoelting Co. | 60136/60035 | These are not the exact products used in the video, but these are essentially identical. |
Platform Cue | - | - | The platform cue used was created using a small metal stand and white spherical foam ball. These can likely be purchased at any store with home improvement materials (i.e. Walmart, Rona etc.) |
Mainstays 71" Floor Lamp | Walmart | HW-F0377SLV | |
ANY-Maze Behavioural Tracking Software | Stoelting Co. | 60000 | There are ANY-maze® bundles that include the camera with or without a computer and accessories. |
Compact Video Camera | Logitech | V-U0023 | |
Laptop | Hewlett-Packard | HP Pavilion dv6 Notebook PC | Laptop Specifics: AMD A6-3420M APU with Radeon HD Graphics 1.50 GHz, 6.00 GB RAM, 64-bit operating system. |
Americana Non-toxic Acrylic Paint | DecoArt | DAO67-9 | This can be ordered on the DecoArt site or purchased in store at DecoArt retailers. |
Poster Board | Walmart | PA-1961 |
References
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