Parçacık izleme Microrheology tarafından Biyofilmler Mekanik Özelliklerinin Yerinde Haritalama
Summary
Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.
Abstract
Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.
Introduction
Çoğu bakteri hücrelerinin hem planktonik (serbest yaşayan) ve büyümeye 1. yüzey bağlı (sesil) modları istihdam edebiliyoruz. Büyüme yüzeyi bağlı modunda, bakteri hücreleri salgılar ve hücre dışı polimerik maddeler (EPS) biyofilm oluşturmak için büyük miktarlarda kendilerini örten. EPS esas olarak protein, eksopolisakaritin, hücre dışı DNA'dan oluşur ve biyofilm 2 için gereklidir. Bu bakteriler mekansal farklılaştırmak için kullanabileceğiniz ve zararlı çevresel koşullar ve ev sahibi yanıtlardan bakterileri korur hangi tarafından fiziksel bir iskele olarak hizmet vermektedir. EPS farklı bileşenleri dramatik biyofilm yapıları 4 pişmanlık olabilir EPS bileşenleri ifadesinde biyofilm oluşumu 3 ve değişiklikler farklı rollere sahiptir. EPS bileşenleri molekülleri 5 sinyal olarak işlev görebilir ve son çalışmalar onların göç ve biyofilm diff rehberlik mikrobiyal hücrelerin ile etkileşim bazı EPS bileşenleri göstermiştirerentiation 6-8.
EPS Araştırma ölçüde EPS 9,10 belirli bir bileşeni kusurlu mutantlar tarafından üretilen biyofilm morfolojik analizler dayalı gelişmiş etmiştir. Buna ek olarak, EPS genellikle makro ölçekli (toplu karakterizasyonu) 11 de karakterize edilir. Morfolojik, ortalama değerleri döndürür biyofilm heterojenliğinden içinde var detay kaybeder nicel detay ve dökme karakterizasyonu, yoksun olabilir, ancak analiz eder. Mikro ölçekte EPS mekanik özelliklerinin gerçek zamanlı karakterizasyonu ilerleme artan bir eğilim artık yoktur. Bu protokol parçacık izleme microrheology Pseudomonas aeruginosa biyofilm 4 viskoelastisite ve etkin çapraz bağlanma üzerinde matris bileşenleri Pel uzaysal efektleri ve PSL eksopolisakaridleri belirlemek mümkün gösterilmiştir.
Pasif microrheology basit ve ucuz bir rh olduğunugüncel 12,13 bir malzemenin uzaysal microrheological örnekleme yüksek verim sağlar eology yöntemi. Pasif microrheology, prob küreler örnek yerleştirilir ve termal enerji (k B-T) ile tahrik edilen kendi Brown hareketi, bir video mikroskobu ile takip edilir. Çeşitli parçacıklar aynı zamanda izlenebilir ve parçacıkların zamana bağlı koordinatları geleneksel bir rastgele yürüyüş izleyin. Bu nedenle, ortalama olarak, parçacıklar aynı konumda kalır. Ancak, yer değiştirmelerin standart sapma veya ortalama parçacıkların deplasman (MSD) karesine, sıfır değildir. Viskoz sıvılar akış beri zaman ilerledikçe, yapışkan bir sıvı içindeki parçacık MSD doğrusal büyür. Buna karşılık, polimerik çapraz viskoelastik bulunan veya elastik maddeler onları akışını karşı yardımcı olur ve partiküller MSD eğrisinin (Şekil 1A) yaylalara lider, kendi yerinden sınırlı olur. Bu gözlem, bir ilişki aşağıdaki MSDαt <sα maddenin elastik ve viskoz katkıları oranı ilgili Pasif üs a> kadar. Viskoelastik maddelerin <α <1, ve elastik maddeler α 0 viskoz sıvılar içinde hareket eden parti kül α = 1 için, = 0 MSD aynı zamanda malzemenin eğilimi sürekli fazla deforme olan bozulma uyumu hesaplamak için kullanılabilir zaman ve nasıl kolayca malzeme yayılır tahmin ediyor.
Parçacığın boyutu, yoğunluğu ve yüzey kimyası microrheological deney doğru bir şekilde uygulanması için kritik olan ve (bu durumda biyofilm matris polimerleri, Şekil 1B'ye bakınız) ele sistemine göre seçilir. İlk olarak, partikül parçacık kendisinden çok daha küçük olan yapılarla maddenin reolojisini ölçer. Maddenin yapısı parçacığın, par hareketine benzer ölçek isenizTICLE münferit yapıların şekli ve yönelimi rahatsız edilir. Ancak partikülü saran yapıların daha küçük olması durumunda, bu etki, küçük olan ve parçacık (Şekil 1B) homojen bir ortamı gösteren, ortalama. İkincisi, parçacığın yoğunluğu sedimantasyon kaçınılması ve atalet kuvvetleri ihmal edilebilir, öyle ki (su bazlı ortamlar için 1.05 g ml -1) orta benzer olmalıdır. Polistren örgüleri olan çoğu parçacıklar yukarıdaki kriterleri karşılayan. Hareket maddesi yapıları ile termal enerji ve çarpışma ile tahrik rasgele ise, partikül MSD reolojik yorumlanması geçerlidir İdeal olarak, partikül biyofilm matris polimer ile etkileşmez. Bu prob partikül bağlamak veya bir ön yetişkin bir biyofilm yüzey öteye sıçrama eğiliminde olmaktadır olup olmadığının kontrol edilmesiyle görülmektedir. Ancak, biyofilm çekim olmamasına rağmen, parçacıkların matris içine dahil edilmesi gerekir.Buna ek olarak, biyofilm fizikokimyasal heterojenite Farklı parçacıklar biyofilm farklı bölgelerinde problar olarak daha uygun olan neden olabilir. Bu nedenle, farklı ebatlarda ve yüzey kimyası parçacıkları biyofilm uygulanmalıdır.
Bunun gibi, parçacık MSD bileşenleri reolojisine katkıda bulunmak ve biyofilm yayılması ne kadar farklı hakkında yararlı bilgiler verebilmektedir. Ayrıca, farklı prob kullanımı, bir biyofilm mekansal fizikokimyasal heterojenite hakkında bilgi elde sağlar. Bu yöntem, biyofilm mekanik özellikleri başka bir türden getirilmesi değiştirilir araştırmak karışık türleri biyofilm biyofilm mekanik özellikleri üzerindeki etkisi antibiyotik tedavisi test etmek için kullanılır ya da uygulanabilir. Parçacık KİSH'lerin biyofilm dağıtmasına karakterize etmek için yararlı olabilir. Bu tür çalışmalar bir potansiyel biyofilm tedavileri geliştirmek, biyofilm anlayışımızda yararlı olacaktıryararlı faaliyetler için biyofilmlerin nd mühendisliği.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microrheology gibi mikrobiyel filmlerin olarak heterojen sistemler, yerel reolojik ölçümler için yararlı bir araçtır. Birden fazla kez puan üzerinden aynı biyolojik numune içinde reolojik değişikliklerin gerçek zamanlı izleme sağlayan bir tahribatsız tekniktir. Bu protokolde, partikül izleme microrheology onlar elastikiyet ve biyofilm matrisi etkin çapraz bağlanmasını nasıl etkilediğini araştırmak için Pel ve PSL ekzopolisakkarit mutantlar uygulandı. Pel viskoelastik ve gevşek biyofilm yanad?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Mükemmellik Programı kendi Araştırma Merkezi kapsamında Eğitim Singapur Ulusal Araştırma Vakfı ve Bakanlık tarafından desteklenen, Başlangıç Hibeler Nanyang Technological University (M4330002.C70) ve AcRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) Milli Eğitim Bakanlığı, Singapur. Yazarlar bu protokolün gösteriye katılmak için Joey Yam Kuok Hoong teşekkür ederiz.
Materials
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescent Microscope | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltic pump |
| Flow Cell Chambers | Technical University of Denmark | ||
| Bubble Trap | Technical University of Denmark | ||
| Silicone Tubing | Dow Corning | 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter | |
| Clear polypropylene plastic connectors | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1.588 mm) |
| Binder Clips | To clamp tubing | ||
| Coverslips | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Syringe 3 mL | Terumo | ||
| 27G Needle | Terumo | ||
| 2L Storage/Media Bottles | VWR® | ||
| Trolley | To hold biofilm setup | ||
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A. Microrheology of complex fluids. Rep Prog Phys. 68, 685-742 (2005).
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383 (2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
