Imagerie du trafic intracellulaire de l'APP avec la GFP photoactivable
Summary
Bien que le transport des protéines de la surface cellulaire est relativement facilement étudiée en visualisant le trafic des protéines intracellulaires est beaucoup plus difficile. Ici, nous utilisons des constructions incorporant GFP photoactivable et démontrons une méthode pour suivre avec précision la protéine précurseur de l'amyloïde à partir de l'appareil de Golgi à compartiments en aval et de suivre son jeu.
Abstract
Bêta-amyloïde (Aß) est le constituant majeur des plaques séniles trouvés dans les cerveaux de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Aß est dérivé du clivage séquentiel de la protéine précurseur amyloïde (APP) par β-sécrétase et y. Malgré l'importance de Aß à AD pathologie, la localisation subcellulaire de ces clivages ne sont pas bien établie. Travaillent dans notre laboratoire et d'autres impliquent le système endosomal / lysosomale dans la transformation d'APP après internalisation de la surface de la cellule. Cependant, le trafic intracellulaire de l'APP est relativement peu étudié.
Bien protéines de surface cellulaire sont amendable à de nombreuses techniques de marquage, il n'y a pas de méthodes simples pour suivre le trafic des protéines membranaires de l'appareil de Golgi. À cette fin, nous avons créé des constructions d'APP qui ont été marqués avec des photo-activable GFP (paGFP) à l'extrémité C-terminale. Après synthèse, paGFP a une faible fluorescence basale, mais il peut être stimulé avec 413 nm lumière to produire une forte fluorescence verte, stable. En utilisant l'appareil de Golgi marqueur Galactosyl transférase couplé à Cyan Fluorescent Protein (GalT-PCP) comme une cible, nous sommes en mesure de précision photoactiver APP dans le réseau trans-Golgi. Photo-activé APP-paGFP peut alors être suivie comme il trafique à compartiments aval identifiés par fluorescence protéines marquées marqueurs compartiment pour l'endosome précoce (Rab5), l'endosome tardif (Rab9) et le lysosome (LAMP1). En outre, l'utilisation d'inhibiteurs de la transformation d'APP, y compris la chloroquine ou la γ-sécrétase inhibiteur L685, 458, nous sommes en mesure de réaliser des expériences pulse-chase d'examiner le traitement de l'APP dans des cellules individuelles.
Nous trouvons qu'une grande partie de l'APP se déplace rapidement vers le lysosome sans apparaissant à la surface de la cellule, et est ensuite éliminé du lysosome par clivages sécrétase. Cette technique démontre l'utilité de paGFP pour suivre le trafic et le traitement des protéines intracellulaires from le Golgi à compartiments aval.
Introduction
La caractéristique de la maladie d'Alzheimer (MA) est la présence de plaques séniles et les dégénérescences neurofibrillaires (NFT) de dans le cerveau. Le constituant majeur des plaques séniles est β-amyloïde (Aß). Aß est dérivé de son précurseur; protéine précurseur de l'amyloïde (APP) 1. Le clivage de l'APP amyloïdogène commence avec élimination de l'ectodomaine de l'APP par β-sécrétase 2. Le 99 résidus fragment terminal carboxyle restant (FCT) peut être clivée par γ-secrétase pour produire Aß 3-7. Bien que de nombreuses expériences ont démontré le clivage de l'APP surface de la cellule après l'internalisation de la surface de la cellule dans le système endosomique / lysosomique, un certain nombre d'études récentes ont suggéré que le trafic intracellulaire de l'APP est également important dans la régulation de son traitement 8-11.
Il y a eu un certain nombre de tentatives de moduler les niveaux d'Aß avec des inhibiteurs de y-sécrétase et d'Aß immunotherapies. Cependant, de récents essais cliniques avec ces thérapies ont montré aucun avantage, et, dans certains cas, a causé un préjudice 12. Une stratégie inexploité pour moduler la production d'Aß est de modifier la localisation sub-cellulaire de l'APP et de l'interaction γ-sécrétase. L'appareil de Golgi, la membrane plasmique et les endosomes, lysosomes / ont tous été proposés comme lieux possibles de γ-clivage de l'APP. Recherche dans notre laboratoire suggèrent que l'APP et la γ-sécrétase sont des protéines résidentes de la membrane lysosomale 13. En outre, nous avons constaté que la lysosomales γ-sécrétase a un pH optimal acide 13. En outre, l'alcalinisation du système endosomique / lysosomique par la chloroquine ou de NH 4 Cl, on a démontré à diminuer la production de Aß 14. y-sécrétase inhibition ou KO ou Presenilin conduit à l'accumulation APP-FFC dans le lysosome 15-17. En outre, perturbant APP endocytose abaisse la production Aß 18-20.
Malgré l'importance de l'appareil de Golgi comme une station de tri pour les protéines et les protéines recyclés à partir du système endosomal / lysosomale naissantes, le trafic intracellulaire de l'APP n'a pas été étudié en détail 21. Des travaux récents ont montré que l'APP peut être recyclé dans le réseau trans-Golgi (TGN) via une interaction avec le complexe de rétromère. Régulation négative du complexe rétromère diminue la production d'Aß 8,22-24. Cependant, la sortie de l'APP de l'appareil de Golgi n'a pas été bien étudiée.
En suivant l'endocytose des protéines de surface cellulaire, tels que le récepteur de la transferrine, sont facilement marqué et suivi, suivant le trafic des protéines intracellulaires est plus difficile. En fait, peu de protéines ont eu leur trafic intracellulaire imagé. L'avènement des étiquettes protéiques fluorescents, tels que les photo-activable-GFP (paGFP), a fourni de nouveaux outils pour étudier le trafic intracellulaire. Photo-activable-GFP est une forme de GFP qui est presque invisible après la synthèse, mais développe verte (GFP) une forte fluorescence après avoir été activé par la lumière laser de 413 nm, et ce signal est stable pendant des jours 25,26. Constructions utilisant paGFP ont été utilisées pour démontrer la traite intralysosomale de la protéine lysosomale protéine de la membrane 1 (LAMP1) 25, la livraison de la surface cellulaire de la de la stomatite vésiculaire Virus Glycoprotein (VSVG, un marqueur de la voie de sécrétion) 27, et le chiffre d'affaires des peroxysomes 28 et 29 autophagosomes.
Afin de visualiser le tri des APP à partir du TGN dans les cellules vivantes, nous avons conçu plasmide exprimant les derniers 112 acides aminés de APP couplés à photo-activable (paGFP) sur l'extrémité C-terminale (ci-après paGFP-ßAPP) 30. Nous avons également procédé ces expériences avec pleine longueur APP et obtenu des résultats similaires; la construction de ßAPP est utilisé ici car il fournit des images plus lumineuses. Nous avons ensuite photo-activation et# 946; APP-paGFP seulement dans le TGN, identifié par le TGN marqueur galactosyltransférase (GalT). Bien que l'APP a été étiqueté avec paGFP de visualiser le transport axonal rapide de l'APP et de la clairance de la région périnucléaire, ceci est la première démonstration de l'APP traite d'un compartiment soigneusement définis pour une autre 11,31,32. Ici, nous démontrons précise photo-activation dans le TGN et la sortie de l'APP en compartiments aval et ensuite clivage et la clairance de 30 lysosomes. Le photo-activation précise à l'intérieur de l'appareil de Golgi est largement applicable à d'autres systèmes protéiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette technique décrit la photo-activation précise des protéines membranaires marqués avec paGFP dans le TGN pour visualiser le trafic et clivage subséquent. Alors que paGFP a été créée il ya une décennie 25, ceci est le premier exemple de photo-activation précise à suivre le trafic des protéines naissantes à compartiments aval. Des études antérieures utilisant APP-paGFP constructions photo-activé une région péri-nucléaire de la cellule, qui a été considéré comme l'appareil de Golg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
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