Экстракорпоральное анализе измерить фосфатидилэтаноламина метилтрансферазы активность

Summary

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Abstract

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

Introduction

Фосфатидилэтаноламин метилтрансферазы (PEMT) ферменты катализируют ковалентное присоединение одной или более метильными группами с использованием S -adenosylmethionine (SAM) в качестве донора метильной группы на ПЭ, ПЭ-монометиловый или диметил-PE, чтобы дать монометиловый-PE, диметил-PE и / или фосфатидилхолин (PC). Эти ферменты почти повсеместно в клетках животных и грибов. Они также могут быть найдены в некоторых растений ^{1 и} примерно 10% бактерий, особенно те, которые взаимодействуют с эукариот ^2.

PEMTs имеют отношение к биологии клетки не только вклад в производстве ПК, который является основным классом липидов в клетках животных, но также выполняет другие важные клеточные функции. У млекопитающих, в основном PEMTs экспрессируется в печени, где они необходимы для нормального секреции липопротеины очень низкой плотности, и они также способствуют индуцированным диетой ожирением ^3, атеросклероз ^4, и инсулин сопротивлениеANCE ^5. Кроме того, PEMT млекопитающих также выражены в адипоцитах, хотя на более низкие уровни, и участвовать в отложение жира ^{6, 7.} Было также показано, PEMT роль в развитии рака, апоптозе ^{8 9 и 10} клеточного роста. У бактерий, PEMT ферменты, как было показано, важна для нормального роста клеток ² вирулентности ^{2 и} симбиозе с растения-хозяина ^11.

Цель и обоснование данного протокола является измерение PEMT деятельность с целыми клеточных экстрактов без необходимости очистки фермента. Две различные протоколы были разработаны для измерения PEMT активность. Первый и самый распространенный измеряет передачу тритием метил группы из радиоактивного SAM на ПЭ, которая является темой данной статьи. Этот протокол был изначально разработан для измерения активности PEMT из дрожжей ¹² и в клетках млекопитающих (печени) ^13, чтобы получить understАндинг ПК биосинтеза в этих клетках, а также для определения специфичности этих ферментов. В дальнейшем этот метод был применен к другим типам клеток, таких как бактерии ^{2 (с} помощью базового значения рН для анализа, хотя ^{15) и} простейшими паразитами ^14. Эта методика может быть использована с целым клеточных экстрактов, а также очищенный фермент, и потенциально могут быть применены к любому клеточного экстракта системы. A Non радиоактивных анализ был также разработан, которая опирается на ферментативной количественного S -adenosylhomocysteine, в трансметилирования продукта SAM ^16. Последнее анализ может быть более удобно, так как не предполагает радиоактивности, но это подходит только для очищенных ферментов.

Protocol

1. Подготовка экстракт клеток Выращивают клетки Leishmania в стерильной пластиковой бутылки запечатанной крышкой герметично при 26 ° С в среде из 1x M199 с добавкой 20 мМ HEPES рН 7,4, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 5 мкг / мл гема , 0,35 г / л Naco 2 Н, 0,1 мМ аденина и 2 мкг / мл biopt…

Representative Results

На рисунке 1 показана времени зависит PEMT анализа, который проводили с Leishmania экстракта цельноклеточной качестве источника фермента с использованием эндогенной PE в качестве субстрата. Количество радиоактивности в органической фазе количественно с помощ…

Discussion

Это просто, быстро PEMT анализ позволяет количественно метилированных форм ПЭ, что приводит от переноса радиоактивных метильных групп из SAM на ПЭ, используя экстракт цельных клеток в качестве источника белка. Это быстро, чувствителен, воспроизводимым, а также подходит для очищенных ферм?…

Materials

S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine (specific activity of 5-15 Ci/mMole)	Perkin Elmer	NET155050UC	Aliquot the reagent and freeze at -20 °C; follow radiation safety guidelines while using this reagent
Protease inhibitor cocktail	Roche Life Sciences	11836170001	dilute it fresh
Glass beads, acid washed, 425-600 mm	Sigma Aldrich	G8772
Bicinchoninic acid solution	Sigma Aldrich	B9643
Copper (II) sulfate	Sigma Aldrich	C2284
Scintillation counter MicroBeta2 with 1-detector	Perkin Elmer	2450-0010
Spectrophotometer Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
BSA stock solution (10 mg/ml)	New England Biolabs	B9001S
Scintillation liquid	Research Product International Corp	111198
S-(5'-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride)	Cayman Chemicals	13956	dilute the reagent in 20 mM HCl and freeze aliquots at -80 °C