In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

Summary

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Abstract

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

Introduction

Fosfatidiletanolamina metiltransferasi (PEMT) enzimi catalizzano l'attacco covalente di uno o più gruppi metilici utilizzando S -adenosylmethionine (SAM) come il gruppo metilico donatore sul PE, PE o monometil-dimetil-PE dare monometil-PE, dimetil-PE e / o fosfatidilcolina (PC). Questi enzimi sono quasi onnipresenti nelle cellule animali e funghi. Possono anche essere trovati in alcune piante ^{1 e} circa il 10% dei batteri, in particolare quelli che interagiscono con eucarioti ^2.

PEMTs sono rilevanti alla biologia della cellula non solo contribuendo alla produzione di PC, che è la classe principale lipidi nelle cellule animali, ma anche compiendo altre importanti funzioni cellulari. Nei mammiferi, PEMTs sono espressi principalmente nel fegato dove sono richiesti per il normale secrezione di lipoproteine ​​a bassissima densità e contribuiscono anche all'obesità indotta dalla dieta ^3, aterosclerosi ^4, e l'insulina resistonoANCE ^5. Inoltre, PEMT mammiferi sono espressi anche negli adipociti, anche se a livelli più bassi, e partecipare a deposizione di grasso ^{6, 7.} Ruolo PEMT nello sviluppo del cancro ^{8, 9} apoptosi, e la crescita delle cellule ¹⁰ sono stati anche dimostrato. Nei batteri, enzimi PEMT hanno dimostrato di essere importante per la normale crescita delle cellule ^2, la virulenza ^2, e simbiosi con la pianta ospite ^11.

L'obiettivo e le motivazioni del presente protocollo è quello di misurare l'attività PEMT da estratti cellulari interi, senza la necessità di purificare l'enzima. Due protocolli distinti sono stati sviluppati per misurare l'attività PEMT. Il primo e più comune misura il trasferimento del gruppo metilico triziata da SAM radioattivo su PE, che è l'argomento di questo articolo. Questo protocollo è stato originariamente sviluppato per misurare l'attività PEMT dal lievito ¹² e cellule di mammifero (fegato) ¹³ per ottenere un understANDing di biosintesi PC in queste cellule, nonché per determinare la specificità di questi enzimi. Successivamente, questa tecnica è stata applicata ad altri tipi di cellule, come i batteri ² (utilizzando un valore pH basico per il test se ¹⁵⁾ e protozoi parassiti ^14. Questa tecnica può essere utilizzata con estratti cellulari interi nonché enzima purificato, e può potenzialmente essere applicato a qualsiasi sistema di estratto cellulare. Un test non radioattivo è stato progettato che si basa sulla quantificazione enzimatica di S -adenosylhomocysteine, il prodotto di transmetilazione SAM ^16. Quest'ultimo test può essere più conveniente in quanto non comporta radioattività ma è adatto solo per gli enzimi purificati.

Protocol

1. cella estratto Preparazione Crescere le cellule Leishmania in una bottiglia di plastica sterile, sigillato con tappo a tenuta d'aria a 26 ° C in un mezzo fatto di 1x M199 supplementato con 20 mM HEPES pH7.4, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 5 mg / ml eme , 0,35 g / L Naco 2 H, adenina mM 0.1, e 2 mg / ml biopterina senza agitare. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1.500 g per 5 minuti a 4 ° C quando raggiungono una densità cellulare di 1-2 x 10 <…

Representative Results

La figura 1 mostra un tempo dipendente PEMT dosaggio, che è stata effettuata con Leishmania estratto cellula intera come fonte dell'enzima utilizzando PE endogena come substrato. La quantità di radioattività nella fase organica è stata quantificata mediante conteggio a scintillazione. I numeri ottenuti sono stati utilizzati per calcolare la quantità di gruppi metilici triziata trasferiti verso PE. L'attività PEMT era lineare per circa 20 min. È qu…

Discussion

Questa semplice, rapido test PEMT consente la quantificazione di forme metilate di PE che deriva dal trasferimento di gruppi metilici radioattive da SAM su PE utilizzando estratto cellulare tutto come fonte proteica. È veloce, sensibile, riproducibile e adatto anche per enzimi purificati ^17. Monomethyl- o dimetil-PE possono essere aggiunti al test se il metiltransferasi di interesse specifico per questi substrati anziché PE ^12,13,18,19. Se viene utilizzato purificato enzima PEMT, PE può essere a…

Materials

S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine (specific activity of 5-15 Ci/mMole)	Perkin Elmer	NET155050UC	Aliquot the reagent and freeze at -20 °C; follow radiation safety guidelines while using this reagent
Protease inhibitor cocktail	Roche Life Sciences	11836170001	dilute it fresh
Glass beads, acid washed, 425-600 mm	Sigma Aldrich	G8772
Bicinchoninic acid solution	Sigma Aldrich	B9643
Copper (II) sulfate	Sigma Aldrich	C2284
Scintillation counter MicroBeta2 with 1-detector	Perkin Elmer	2450-0010
Spectrophotometer Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
BSA stock solution (10 mg/ml)	New England Biolabs	B9001S
Scintillation liquid	Research Product International Corp	111198
S-(5'-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride)	Cayman Chemicals	13956	dilute the reagent in 20 mM HCl and freeze aliquots at -80 °C