A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula

Summary

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Abstract

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Introduction

O envelope nuclear (NE) separa o nucleoplasma do citoplasma. É composto por uma membrana nuclear interna e externa (INM e ONM, respectivamente) que se ligam em poros nucleares. O lúmen delimitada pelas duas membranas é chamada o espaço perinuclear (SNP). A ONM é uma extensão do retículo endoplasmático rugoso (ER), eo INM adere à lâmina nuclear, uma malha de nuclear-V Tipo de filamentos intermediários representados por A e do tipo B lamins ^1,2. Ligantes do Nucleoskeleton e do citoesqueleto (LINC) são complexos macromoleculares conjuntos que abrangem todo o envelope nuclear para ligar fisicamente o interior do núcleo de filamentos do citoesqueleto e motores moleculares (Figura 1A). Eles consistem de interações entre motivos evolutivamente conservadas que caracterizam duas famílias de proteínas transmembrana integrantes do NE: Sun (Sad1 / Unc84) proteínas e Nesprins (SPectRINS Envelope Nuclear). Nos mamíferos, Sun1 e Sun2 arproteínas transmembranares e do INM nucleoplásmica cuja região N-terminal interage directamente com A e do tipo B laminas ^3-5. Por outro lado do INM, dentro do SNP, proteínas Sun Harbor um estiramento evolutiva-conservada de ~ 150 aminoácidos C-terminais do domínio chamado sol. SUN domínios interagir diretamente com o evolucionário conservado KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologia) de domínio, a assinatura molecular de Nesprins. Kash domínios consistem de um troço de ~ 30 aminoácidos C-terminais que se projeta para o SNP seguido por um domínio transmembranar ^6. Pelo menos quatro genes distintos (Nesprin1-4 Nesprin) codificam proteínas contendo KASH que localizam no NE ^7. As regiões citoplasmáticos de Nesprins, cujos tamanhos variam de ~ 50 kDa (Nesprin4) para uma surpreendente 1.000 kDa (Nesprin1 gigante), contêm spectrin múltiplas repetições, bem como os motivos específicos permitindo a sua interação com os componentes do citoesqueleto de actina, tais como, plectina e motores moleculares ^{8- 13.}

<p class = "jove_content"> Estudos em vertebrados e invertebrados mostraram que Lamin / Sun / Nesprin / motores moleculares constituem um "eixo" evolutivamente conservada controlar a migração e ancoragem nuclear. Vários knock-out (KO) modelos do rato do LINC componentes complexos têm sido descritos e eram instrumentais em fornecer um quadro para entender os papéis de proteínas Sun e Nesprin no NE durante o desenvolvimento dos mamíferos ^9,14,15. No entanto, estes modelos apresentam várias desvantagens significativas, principalmente: 1) dificuldade em interpretar fenótipos devido à célula efeitos não-autónomos, 2) dificuldade em distinguir as contribuições fenotípicas de KASH contendo vs. KASH-less Nesprin isoformas ^16, 3) a redundância funcional de proteínas Sun e Nesprin no NE em numerosos tipos de células requer esquemas de melhoramento complexas para inativar todas as interacções SUN-Kash em camundongos ^{17 e} 4) a letalidade perinatal de camundongos deficientes para a KASH-domínio de ambosNesprins1 e 2 opõe-se à análise de fenótipos adulto ^18.

Este protocolo descreve um novo modelo de ratinho concebido para romper todas as interacções SOL-Kash in vivo, numa célula de forma autónoma e regulada pelo desenvolvimento, ignorando assim muitas das desvantagens descritas acima. Este modelo de ratinho Cre / à base de LOX assenta em dois conceitos importantes: 1) o domínio KASH de qualquer proteína Nesprin conhecida é suficiente para atingir EGFP ao NE em sistemas de cultura de células e 2) domínios SUN interagir promiscuamente com domínios Kash, portanto, sobre-expressão de qualquer domínio KASH vai saturar todos os domínios SUN endógenos e inactivam os complexos LINC de uma forma dominante negativa ¹⁷ (Figura 1B). Este protocolo descreve a colheita de tecidos e etapas de processamento usados ​​para confirmar a interrupção de todas as interações SUN-Kash em células de Purkinje do cerebelo.

Protocol

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Washington em St. Louis. 1. Rato Reprodução e Genotipagem Raça ratos com Tg Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) (PCP2-Cre) ratos para produzir Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Nota: Embora o restante deste protocolo centra-se na utilização da linha de Tg (PCP2-Cre) do rato para restringir a expressão …

Representative Results

Este protocolo ilustra a utilidade do (EGFP-KASH2 / CAG-LacZ) modelo de ratinho Tg para restringir a expressão EGFP-KASH2 para células de Purkinje do cerebelo usando Tg (PCP2-CRE) ratinhos. Em Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) prole, a grelha de leitura aberta de LacZ / V5 é excisado em P6 pela recombinase Cre conduzindo assim à expressão de EGFP-KASH2 especificamente direccionada para células de Purkinje (Figura 2A). Como esperado, EGFP-KASH2 é voltado para o envelope nuclear, tal como in…

Discussion

O passo mais importante para estudar o papel com sucesso de complexos LINC in vivo utilizando o modelo de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) é identificar uma linha de murganho adequados Cre (s). Com efeito, se Cre está activo em outros tipos de células-envolvidas em vias semelhantes, que podem complicar a interpretação dos resultados. Por isso, é importante examinar as células vizinhas, como mostrado nas camadas celulares e moleculares granulares do cerebelo (Figura 2B). Do mesmo modo, para max…

Materials

Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% Paraformaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15710
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Adhesion Slides	StatLab	M1000W
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Anti-Calbindin Antibody	Sigma Aldrich	C9848
Anti-EGFP Antibody	Abcam	ab13970
Anti-Nesprin2 Antibody			Previously described in Ref. 21
Fluorescent Mounting Media	Dako	S3023
2-methyl butane	Sigma Aldrich	O3551