Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el<em> Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis</em> Patosistema
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
En ausencia de las células inmunes móviles especializadas, las plantas utilizan su localizada muerte celular programada y sistémica resistencia adquirida a defenderse contra el ataque de patógenos. La contribución de un gen de Arabidopsis específica a la respuesta inmune general de la planta puede ser específicamente y cuantitativamente evaluado ensayando el crecimiento de patógenos en el tejido infectado. Durante más de tres décadas, la bacteria hemibiotrophic Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) se ha aplicado ampliamente como el modelo de patógenos para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la respuesta inmune de Arabidopsis. Para entregar agentes patógenos en el tejido de la hoja, múltiples métodos de inoculación se han establecido, por ejemplo, infiltración de la jeringa, la inoculación por inmersión, pulverización, infiltración al vacío, y la inoculación de inundación. El siguiente protocolo describe un método de infiltración jeringa optimizado para ofrecer virulenta PSM ES4326 en hojas de adultossuelo cultivado plantas de Arabidopsis y la pantalla con precisión para una mayor susceptibilidad a la enfermedad (EDS) en dirección a este patógeno. Además, este protocolo se puede complementar con múltiples tratamientos previos para diseccionar más defectos inmunes específicas dentro de las diferentes capas de defensa de la planta, incluyendo el ácido salicílico (SA) Inmunidad -Accionados (ITS) e Inmunidad-Triggered MAMP (MTI).
Introduction
Debido a su naturaleza sésiles, las plantas están constantemente amenazados por una gran cantidad de patógenos que presentan diferentes estilos de vida y estrategias nutricionales 1. En una primera aproximación, los patógenos biotróficos mantienen su huésped vivo para recuperar los nutrientes, mientras que los agentes patógenos necrotróficos toxinas activamente secretas y enzimas para matar tejido del huésped y se alimentan de las células muertas de la 1. Otro grupo de agentes patógenos, hemibiotrophs denominados, comienza su curso con la etapa de la infección biotrófico y los cambios a la etapa necrotrófico al alcanzar un cierto umbral de acumulación patógeno 2. Con el fin de defender eficazmente contra estos microorganismos, las plantas han desarrollado un sistema inmune innato complicada equipado con múltiples mecanismos de vigilancia para detectar el ataque de patógenos y desencadenar la muerte celular localizada 3, así como resistencia sistémica adquirida (SAR) 4 programado. La investigación actual se centra en la caracterización de la sig esencialcomponentes naling y cruzadas conversaciones dentro del sistema inmunológico planta 5.
Tal como se propone en el modelo de "Zig-Zag" 5, la primera capa de la respuesta inmune innata planta requiere la presencia de la membrana plasmática-localizada Patrón receptores de reconocimiento (PRRS) para detectar la invasión de un microbio. Derechos y responsabilidades parentales son capaces de reconocer patrones Microbio asociada Moleculares (mAmps) y establecer Inmunidad-Triggered MAMP (MTI) 6. Además de inducir una regulación positiva de la transcripción de genes que codifican proteínas PR antimicrobianos 7, MTI conduce a una variedad de eventos que la detención del crecimiento de patógenos, incluyendo la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y reactivas de nitrógeno Especies (RNS), deposición de callose a la pared celular así como la activación de la señalización de vías múltiples quinasa 8.
Hasta ahora, varios MAMPs se han identificado para desencadenar MTI en Arabidopsis, incluyendo flg22 bacteriana 9 </sup> (Un fragmento de ácido 22 amino derivado de flagelina), elf18 10 (18 aminoácidos del factor de elongación de la traducción bacteriana Tu) y un componente estructural de la pared celular peptidoglicanos 11. Para establecer una infección exitosa, algunos patógenos especializados han desarrollado la capacidad de las proteínas efectoras secretas virulencia en los espacios intercelulares o intracelulares, y en consecuencia reprimir MTI y desencadenar Susceptibilidad-Triggered efectoras (ETS) 12,13. Por ejemplo, efectores de virulencia pueden inactivar proteína activada por mitógeno cascadas de quinasas (MAPK) fosforilación de MTI para inducir el desarrollo de la enfermedad dentro del tejido infectado 14-16 de. Durante la co-evolución dinámica entre los ejércitos y agentes patógenos, las plantas también desarrollaron la estrategia de contraataque para reconocer las proteínas efectoras y atenuar la virulencia de patógenos moléculas 17. Este reconocimiento directo o indirecto efector está mediada por resistencia a enfermedades (R) 18 proteínas. La mayoría de tdobladillo son miembros de NB-LRR (nucleótidos vinculante y ricos en leucina repite) la familia 19. La percepción de un efector no virulenta por una proteína R provoca una respuesta más fuerte y más amplia inmunológico caracterizado como Inmunidad Accionado efector (ETI) 20. Además de inducir la expresión de genes de defensa 21 y la producción de metabolitos de defensa 22, ETI menudo conduce a una localizada muerte celular programada conocida como hipersensible rápida respuesta (HR) para restringir el patógeno se propague en el tejido adyacente 3.
Además de la muerte celular programada localizada 23, las plantas son capaces de iniciar un largo plazo y la respuesta inmune en todo el sistema denominado Systemic Acquired Resistencia (SAR) 4. Tras la estimulación con un patógeno biotrófico, las células vegetales desencadenan la biosíntesis y acumulación de un ácido fitohormona endógena salicílico (SA) y proteínas PR en ambos tejidos locales y sistémicos 24. A través de tsu proceso, se logra un mayor estado de preparación en las hojas infectadas que permite para el montaje de las respuestas de defensa más rápidos durante una infección posterior por un amplio espectro de patógenos 24. SA y sus análogos sintéticos como el benzo (1,2,3), 7-carbotioico tiadiazol éster del ácido S metil (BTH) y ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA) son capaces de inducir químicamente ácido salicílico (SA) Inmunidad -Accionados (ITS) tras la aplicación externa de 24. Nonexpressor de los genes relacionados con la patogénesis (1 NPR1) se propone para ser uno de los receptores SA y funciona como un importante regulador transcripcional durante la respuesta de defensa mediada por SA en ambos tejidos locales y sistémicos 21,25,26. Se ha demostrado de manera concluyente que NPR1 se requiere para el establecimiento SAR y la pérdida de NPR1 conduce a la susceptibilidad dramática hacia Pseudomonas syringae 25.
Para caracterizar ampliamente la contribución molecular de plantascomponentes en las interacciones planta-patógeno, múltiples bioensayos se han desarrollado para medir acontecimientos de defensa específicos, incluyendo ROS estalló 27, deposición callose 28, genes de defensa expresión y acumulación de sus productos proteicos 21. Si bien estos ensayos individuales pueden proporcionar información en una forma específica de la respuesta inmune de la planta, ninguno de ellos, sin embargo, son capaces de representar la respuesta de defensa completa sobre todo el nivel de la planta. Por el contrario, la cuantificación del crecimiento de patógenos después de la infección proporciona una estimación global de la respuesta inmune a nivel del organismo. Por lo tanto, el desarrollo y optimización de un ensayo de inoculación de patógenos preciso y altamente estandarizado es crítico para alimentar la investigación y descubrimientos en las respuestas inmunes de Arabidopsis.
Pseudomonas syringae, una bacteria Gram-negativa, se identificó como un fitopatógeno capaz de causar enfermedad en una gama de huéspedes vegetales incluyendo Arabidopses 29. A medida que el sistema de la planta de patógenos modelo, la Arabidopsis – P. interacción syringae se ha aplicado ampliamente para comprender los mecanismos moleculares respuestas de defensa de las plantas subyacentes 29. Hasta ahora, más de 50 P. patovares syringae se han identificado basándose en su capacidad para infectar diferentes especies de plantas 30 . P. syringae pv. DC3000 tomate (Pst DC3000) 31 y P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 son las dos cepas virulentas más usados y ampliamente caracterizados. Aparte de ser reconocido por la planta y la activación de la respuesta de MTI, Pst DC3000 y PSM ES4326 son capaces de secretar proteínas efectoras virulentas para suprimir MTI y desencadenar ETS para favorecer el 31,33 crecimiento de patógenos.
Para diseccionar funcionalmente la interacción entre Arabidopsis y P. syringae, múltiple0; métodos de infección de patógenos se han desarrollado sobre la base del enfoque de prestación de patógenos. Para las plantas de suelos cultivados, patógeno puede ser entregado por la infiltración de la jeringa, la infiltración de vacío, la inoculación por inmersión y la inoculación aerosol 29,34. Recientemente, ensayo de inundación de la inoculación de las plántulas fue desarrollado para realizar pantallas de gran escala en el cultivo de tejidos placas cultivadas plantas de Arabidopsis jóvenes 35. Infiltración Jeringa, como uno de los método más comúnmente utilizado, entrega manualmente el patógeno en el apoplasto través de las aberturas de las hojas naturales estomas 29 llamados. A través de este enfoque, la misma cantidad de P. syringae se puede infiltrar en la hoja infectada y la fuerza de la respuesta inmune planta está inversamente correlacionada con los niveles de crecimiento de patógenos. Por lo tanto, la cuantificación del crecimiento de patógenos sirve como un enfoque óptimo para evaluar la función inmune a nivel de planta entera. Además, la infiltración de la jeringa puede distinguir el tejido local y sistémica, que puede be aplicable en la caracterización de los mecanismos moleculares que subyacen a SAR 36.
En el siguiente protocolo, se describe un ensayo de infiltración jeringa optimizado con PSM ES4326 para detectar mutantes de Arabidopsis para una mayor susceptibilidad a la enfermedad (EDS). Este protocolo empleará dos genotipos de Arabidopsis: una de tipo salvaje ecotipo Columbia-0 (Col-0) plantas (de control) y npr1-1 mutantes de pérdida de función (hipersusceptibles) que se infectaron con la cepa bacteriana virulenta PSM ES4326 37. El mutante npr1-1 lleva una mutación puntual dentro de la secuencia de consenso-ankyrin repetida de la molécula NPR1, que altera la histidina altamente conservada en tirosina y hace que la proteína no funcional 25. Además, una serie de modificaciones del ensayo de infiltración de la jeringa se describen que permiten la cuantificación de defectos en las capas específicas de la respuesta inmune, incluyendo MTI y STI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la disminución de las tierras agrícolas disponibles y el aumento de la población, los investigadores de todo el mundo tienen el reto con las necesidades apremiantes para el mejoramiento de cultivos. El rendimiento puede ser muy influenciada por diversos estreses bióticos y abióticos. Entre ellos, la infección por patógenos es una de las principales causas de la reducción del rendimiento de los cultivos, responsable de aproximadamente 12% las pérdidas sólo en los EE.UU. 45. Para resolver este pro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity – direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses – the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
