Mesurer l'attachement et l'internalisation du virus grippal A dans les cellules A549 par cytométrie en flux
Summary
We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.
Abstract
Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.
Introduction
L'entrée de virus de la grippe A (IAV) est un processus en plusieurs étapes qui commence par la liaison du virus aux récepteurs sur la membrane plasmique des cellules cibles 1. Le récepteur de l'acide sialique est IAV qui est présente sur une grande variété de glycoprotéines et des glycolipides. La protéine hémagglutinine (HA) de IAV qui est présent dans l'enveloppe virale se lie à l'acide sialique et médie ainsi la fixation des particules virales à la membrane plasmique de cellules cibles 2. Le virus pénètre dans les cellules par endocytose clathrine mais aussi les voies d'entrée alternatifs, tels que macropinocytose, ont été décrits 3-6. L'interaction entre HA et l'acide sialique semble être suffisante pour la médiation à la fois, l'attachement et le déclenchement de l'internalisation de particules virales 7. Néanmoins, les récepteurs d'entrée alternatives ont été proposées et leurs rôles dans IAV entrée sont actuellement à l'étude 1,8,9.
Cabotment, des efforts sont faits pour identifier les facteurs de l'hôte qui sont impliqués dans le cycle de vie du virus dans le but de développer de nouveaux traitements antiviraux nécessaires de toute urgence 10-12. L'entrée du virus serait une étape favorable pour cibler la croissance IAV afin de bloquer l'infection virale à son premier stade. Mesure différentes étapes de IAV entrée expérimentalement est généralement difficile que de grandes quantités de virus sont nécessaires pour détecter des virus entrant. En outre, la plage de détection des variations de l'entrée du virus est uniquement linéaire en raison de l'absence de réplication virale. Cela souligne la nécessité pour les essais avec une grande sensibilité.
Le test que nous présentons ici permet la détection de virus attaché à la surface des cellules ainsi que la détection de virus internalisé par rapport à la quantité totale de virus associé aux cellules. L'utilisation de virus de type sauvage biotinylé permet une mesure pratique à travers la coloration avec STV-Cy3 et la lecture par cytométrie de flux. Virus biotinylé est froid lié à la cellules pour permettre la fixation mais empêche l'internalisation des particules virales. Les cellules peuvent être fixées, perméabilisées et colorées avec STV-Cy3 pour mesurer virus en pièce jointe. Le signal provenant de virions extracellulaires, attachés peut être abrogée si une étape de blocage est appliqué avant la fixation, dans lequel les cellules sont incubées avec de la streptavidine non marqué (STV). Dans une prochaine étape, après la fixation du biotinylé IAV, la température est décalée à 37 ° C et l'internalisation des particules virales est autorisé à prendre place. Particules internalisées sont protégés de liaison de STV permettant ainsi à la discrimination entre les virus extra- et intracellulaires.
Par condition expérimentale, quatre échantillons sont nécessaires: «0 min»: Le premier échantillon, appelée «0 min», est de mesurer le virus froid lié à la surface de la cellule. '0 min + STV': Le deuxième échantillon, appelée «0 min + STV», donne la ligne de base l'intensité du signal de l'expérience. Virus en pièce jointe est bloquée esprith STV et le signal après coloration avec STV-Cy3 devraient être beaucoup plus faible par rapport à l'échantillon «0 min». '30 Minutes ': Le troisième échantillon, '30 minutes' contient fixée intériorisé et le virus en raison de la variation de température à 37 ° C pendant 30 min. '30 Min + STV ': Le quatrième échantillon, '30 min + STV »mesure la fraction intracellulaire des virus. L'étape de blocage STV est appliqué après la période d'incubation de 30 min. Par conséquent, les particules virales à la surface des cellules sont liés par STV laissant seulement les virus internalisés disponible pour la coloration avec STV-Cy3. La quantité relative de virus intériorisé peut être calculé comme le ratio du virus intériorisé (mesurée dans le '30 min + STV 'échantillon) divisée par la quantité totale de virus (décrit par le '30 minutes' échantillon).
Comme témoins, nous proposons d'inclure des cellules pseudo-infectées. Le signal suivant STV-Cy3 coloration des cellules pseudo-infectées donne l'arrière-planrésultant du protocole de coloration. Un contrôle pour la fixation IAV est le pré-traitement des cellules avec la neuraminidase bactérienne (NA). NA hors clive l'acide sialique à partir de glycoprotéines cellulaires, éliminant ainsi les récepteurs de fixation à partir de la surface cellulaire. L'azoture de sodium (SA) est un inhibiteur métabolique puissant et bloque ainsi l'endocytose 13. Les cellules traitées avec de l'azoture de sodium devraient être positifs pour la liaison du virus mais négatif pour l'internalisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre protocole décrit un moyen facile de mesurer l'attachement du virus et de l'internalisation par cytométrie de flux. Il permet l'utilisation de virus de type sauvage marqué qui imite plus étroitement les infections virales par rapport à l'utilisation de particules de type virus (VLP). Alors que notre protocole a été optimisé pour mesurer l'attachement et l'internalisation des IAV il peut facilement être adapté à d'autres virus. En outre, comme la cytométrie de flux est utilis?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation national suisse (31003A_135278) à SST. MOP est le bénéficiaire d'une bourse doctorale du Fonds AXA pour la Recherche. Nous remercions Patricia Nigg de l'aide à la conception de la figure 1.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
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