臭気誘導挙動の高分解能定量<em>キイロショウジョウバエ</em>使用<em> Flywalk</em>パラダイム
Summary
自動追跡システムFlywalkは、 キイロショウジョウバエにおける臭気誘導挙動の高解像度の定量化のために使用されます。
Abstract
それらの天然の環境では、このような酢ショウジョウバエを飛ぶ昆虫としては、化学的に異なる臭気物質の膨大な量にさらされています。さらに問題を複雑にし、昆虫の神経系で検出された臭いは、通常、その組成及び濃度比異なり、単一の化合物が、混合物ではありません。これは、神経系によって評価する必要が異なる嗅覚刺激のほとんど無限量につながります。
匂い刺激の態様はハエによりその評価を決定するかを理解するためには、効率的に多くの臭気物質や臭気混合物に向かって臭気誘導挙動を検討することが望ましいです。直接神経活動への行動を相関させるために、動作は、同等の時間枠内や神経生理学実験のように、同一の刺激条件の下で定量化する必要があります。しかし、 ショウジョウバエの神経動物行動学における多くの現在使用されている嗅覚バイオアッセイはステーキむしろあります効率に向かってまたは解決に向けどちらかlized。
Flywalk、自動化された臭気の配信と追跡システムは、効率性と解像度間のギャップを埋めます。これは、臭気パケットが自由に歩いてフライを刺激し、animal'sに動的な挙動反応を決定するために、正確にいつの決意を可能にします。
Introduction
任意のneuroethological研究の包括的な目標は、単一ニューロンまたは神経回路の活動状態や生物の行動との因果関係を確立することです。この目標神経活動と行動を達成するために、同一の刺激条件の下で監視されるべきであり、これらの刺激条件は、理想的に精査下神経系はの意味を理解するために進化したものと同様である必要があります。それは行動のバイオアッセイに来るとき特に、これらの要件は、歴史的に非常に嗅覚神経動物行動学ショウジョウバエショウジョウバエに厳しいことが証明されています。
ソースから解放されると、臭気プルームは急速に空気の動きが臭い分布1の主な決定要因であることに起因する乱流拡散に細いフィラメントに別れます。その結果、臭気源に向かって移動する昆虫は、きれいな空気の可変間隔で散在臭気パッケージと断続的な刺激を経験します。両ウォーキングや昆虫飛行- ショウジョウバエ含めて- 5 –臭2の不在下で横風を動かす主にプルームの遭遇時に風上押し寄せると、ナビゲーションのために、この断続的な刺激体制を活用することが実証されています。このようなトラップアッセイなどのショウジョウバエ神経動物行動学で使用される11、多くの行動のバイオアッセイ–生理実験における刺激手順のに対し、主に昆虫がきれいな空気または動的刺激系列6の延長期間が散在する悪臭のいずれかの提供する単一のパフによって、その自然環境の中で発生する可能性があり、それらの模倣15 – 、オープンフィールドアリーナまたはT迷路は臭気勾配12に依存しています。定義により匂い勾配が臭気源からの距離に応じて濃度が可変であるため、しかし、特定の動作は、これらのパラダイムを使用して、正確な臭気濃度に起因することはできません。加えて、勾配匂い勾配が批判臭剤の物理化学的特性に依存します。誤った解釈につながる可能性が20、 –揮発性の高い化合物の勾配は、揮発性の低い化合物によって作成されたものよりも浅いとナビゲーション16の唯一の手段として、空間内の濃度差を測定することに依存する生物のために追跡するためにも難しくなります特に選択アッセイにおける嗅覚嗜好の。臭気混合物に向けて行動を調査するとき、それは空間内のすべての点で異なるブレンド成分の比率につながるため、再び生理と行動との間に明確な相関関係を排除するため、この効果も非常に有害です。
酢のハエが果物を発酵に凝集する傾向があるが、それらは食料源と産卵サイトに対する彼らのナビゲーションで孤独です。それにもかかわらず、個々の動物をテストするのではなく、多くの行動パラダイムは、 ショウジョウバエ neuroetholoで使用GYは、ハエのコホートの匂い誘導挙動を調べ、魅力はコントロール刺激臭の上を選ぶハエの割合として採点されます。これらのコホート実験はフライ神経動物行動学の理解に大きく貢献してきたし、それらを使用して行われた観察の多くは、シングルフライ実験で確認することができました。しかし、各other's決定21に影響を与えることができ、極端な場合には臭気の評価は、人口密度22に応じて回避するために無関心で切り替えることができる飛ぶことが観察されました。さらに、実験のこれらの種類の結果は、多くの場合、神経活動と行動を相関しようとするとことが望ましいであろう、むしろ、それはそれをやっている間にその場で何が行われているか観察するよりも、行動決定のシーケンスの唯一のエンドポイントを提供します。これらのかなり低い解像度のコホート実験は、このようなことができ繋留飛行アリーナやトレッドミルのような高解像度のシングルフライ方法によって対比されます刺激が20,23,24提示された時点での行動反応を直接観察するため。彼らは非常に効率的であり、個人間のと試行間変動するのであっても比較的低いサンプルサイズで堅牢な結果を提供するため、それにもかかわらず、コホート実験は、まだ普及している部分的に起因する長期間にわたって集団の観察に平均化されます。繋留飛行とトレッドミルは、おそらく刺激提示と時間分解能に関するゴールドスタンダードを提供していますが、使用するアリーナは、単一の動物のために設計されており、それは、したがって、時間のかかるサンプルを得るためには、統計分析のために必要なサイズです。他のいくつかのアプローチが最近十分に定義された刺激レジメンと組み合わせた高解像度行動データの効率的な収集を可能にするように開発されてきました。これらは、臭気プルーム5の正確な3次元モデルとの組み合わせで風洞内に複数の酢ハエの教師なし3D追跡を含みます</SUP>、両側25とFlywalkパラダイム26からの空気流が供給される選択肢室内の複数の個々のハエを追跡。
Flywalkでは、15個々のハエは、小さなガラス管に配置されており、継続的に赤色光条件下でのオーバーヘッドカメラで監視しました。臭気は20 cmで/秒の連続的な気流に加え、一定の速度でガラス管を通過しています。気流は、臭気デリバリーシステムに入る前に、蒸留水（加湿）を含む250 mlのボトルを通過させることにより加湿されます。 flies'位置はハエがさらにアップ移動したりすることはできません利息（ROI）の正方形領域臭管の長さの大部分を包含する（ただし、チューブ（各側に約5mmの外縁を除く）内に記録されています風下）臭いプレゼンテーション（ 図1A、B）の頃。フライIDがトラッキングシステムtで一定に保たれますそのY-位置（ すなわち 、そのガラス管の制限）に基づいて実験をhroughout。匂い刺激は、最大8単臭気及び26,29（ 図1B）、そのすべての可能な混合物の提示を可能にする多成分の刺激装置を用いて達成されます。実験の過程は、コンピュータ臭気送達系を調節し、温度と湿度の情報を収集する（コンピュータ1、 図1C）によって制御されます。このコンピュータはまた、継続的に毎秒20フレーム（コンピュータ2）で飛行位置を追跡する別のコンピュータ上のデータロガーを（/ストップ記録を開始）を制御します。位置、臭気バルブの状態（開弁すなわち時点）、臭気ID、匂い刺激サイクルの周囲の温度と湿度をコンピュータ2に臭いにこの方法で情報をログに記録された位置を飛行しているが、これは.csvファイル-ファイルとして同期され、輸出されているフライさらに処理され、カスタム書かれた解析ルーチンを使用して分析することができます。ため、システム全体がコンピュータ制御で、全く人間の介入は、実験セッション中に行う必要はありません。
Protocol
Representative Results
Discussion
Flywalkシステムを一度セットアップし、実行している、一見かなり洗練されたに見えますが、それは使いやすく、非常に堅牢な結果を生成します。バイオアッセイで得られた結果の一貫性を強調するためには、ここに示した代表的な結果は、ほぼ2年新しいトラッキングソフトウェアおよび光源を使用して変更する設定で、以前の研究29に示した結果のいくつかの後に得られたといえま…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは要求のトラッキングソフトウェアをカスタマイズするためのElectricidadeエムPO（electricidadeempo.net）で技術支援のためのダニエル・ファイトとペドロゴーバイアに感謝します。また、撮影処理中にサポートのためにトムRetzkeに感謝します。この研究は、マックス・プランク研究所によってサポートされていました。
Materials
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
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