Högupplöst Kvantifiering av Lukt styrd Beteende i<em> Drosophila melanogaster</em> Använda<em> Flywalk</em> Paradigm

Summary

Det automatiserade spårningssystem Flywalk används för högupplösta kvantifiering av lukt guidad beteende Drosophila melanogaster.

Abstract

I sin naturliga miljö, insekter såsom vinäger flugan Drosophila melanogaster bombarderas med en stor mängd kemiskt distinkta doftämnen. För att komplicera saken ytterligare, de lukter detekteras av insekten nervsystemet är oftast inte enskilda föreningar utan blandningar vars sammansättning och koncentrationsförhållanden varierar. Detta leder till en nästan oändlig mängd olika doft stimuli som måste utvärderas av nervsystemet.

För att förstå vilka aspekter av en lukt stimulans bestämma sin utvärdering av i farten, är det därför önskvärt att på ett effektivt sätt undersöka lukt guidad beteende mot många doftämnen och luktblandningar. För att direkt korrelera beteende till nervaktivitet, bör beteende kvantifieras i en jämförbar tidsram och under identiska stimulans villkor som i neurofysiologiska experiment. Men många som för närvarande används lukt bioanalyser i Drosophila neuroetologi är ganska specielseras antingen mot effektivitet eller mot upplösning.

Flywalk, ett automatiserat system lukt leverans och spårning, överbryggar klyftan mellan effektivitet och upplösning. Det gör det möjligt att bestämma exakt när en lukt paket stimulerade ett fritt gående fluga, och för att bestämma djurets dynamiska beteende reaktion.

Introduction

Det övergripande målet för all neuroetologisk forskning är att fastställa ett orsakssamband mellan verksamhetstillstånd enskilda nervceller eller neuronala kretsar och beteendet hos en organism. För att uppnå detta mål neuronal aktivitet och beteende bör övervakas under identiska stimulans betingelser och dessa stimulans villkor bör helst vara liknande dem nervsystemet under luppen utvecklats för att förstå. Särskilt när det gäller beteende bioanalyser, har dessa krav historiskt visat sig vara ganska krävande i Drosophila melanogaster lukt neuroetologi.

När frigörs från källan, lukt plymer snabbt bryta upp i tunna trådar med turbulent spridning som orsakas av luftrörelser är den viktigaste faktorn för lukt fördelning ^1. Som ett resultat, en insekt navigera mot en luktkälla upplever intermittent stimulering med luktpaket varvas med varierande intervaller ren luft. Bådepromenader och flygande insekter – inklusive Drosophila – har visat sig utnyttja detta intermittent stimulering system för navigering genom böljande upwind på plume möte och huvudsakligen rörliga kors vind i frånvaro av lukt ^{2 – 5.} Medan stimuleringsförfaranden i fysiologiska experiment i stor utsträckning efterlikna de en insekt kan uppleva i sin naturliga miljö genom att antingen ger enskilda puffar av lukt varvas med längre perioder av ren luft eller dynamiska stimuleringssekvenser ^{6 – 11,} många beteende bioanalyser som används i Drosophila neuroetologi såsom fälla analys , frilands arenor eller T-labyrinten lita på lukt-gradienter ^{12 – 15.} Men eftersom lukt gradienter per definition är variabel i koncentration beroende på avståndet från luktkällan, ett visst beteende kan inte tillskrivas en exakt lukt koncentration med hjälp av dessa paradigm. Dessutom lutningen aven lukt lutning beror kritiskt på fysikalisk-kemiska egenskaperna hos luktämnen. En gradient av en mycket flyktig förening kommer att vara grundare än den som skapas av en mindre flyktig förening och därför också svårare att spåra för en organism förlitar sig på mätning av koncentrationsskillnader i rummet som det enda medlet för navigering ^{16 – 20,} vilket kan leda till en felaktig tolkning av lukt preferenser framför allt i valet analyser. Denna effekt är också mycket skadliga vid utredning beteende mot luktblandningar eftersom det leder till olika blandningskomponentförhållanden vid varje punkt i rymden och därför återigen utesluter ett klart samband mellan fysiologi och beteende.

Medan ättika flugor tenderar att aggregera på jäsa frukt, de är ensamma i sin navigering mot matkällor och äggläggning webbplatser. Ändå snarare än testa enskilda djur många beteende paradigm som används i Drosophila neuroethology undersöka lukt guidad beteende kohorter av flugor och attraktion gjorde den fraktion av flugor väljer lukten över en kontroll stimulans. Dessa kohort experiment har i hög grad bidragit till förståelsen av flyg neuroetologi och många av de iakttagelser som gjorts genom att använda dem kunde bekräftas i en enda fluga experiment. Det har emellertid visat sig att flugor kan påverka varandras beslut ²¹ och i extrema fall bedömningen av en lukt kan växla från likgiltighet till undvikande beroende på befolkningstätheten ^22. Dessutom, resultat från dessa typer av experiment ger ofta bara slutpunkten av en sekvens av beteende beslut snarare än att observera vad flugan gör när den gör det, vilket skulle vara önskvärt när man försöker att korrelera beteende med nervaktivitet. Dessa ganska lågupplösta kohort experiment kontrasteras av högupplösta enda gylf metoder såsom bundna flygarenor och löpband, som tillåterför en direkt observation av beteendereaktioner vid tidpunkten för stimulus presenteras ^20,23,24. Ändå kohort experiment är fortfarande populära, eftersom de är mycket effektiva och ger robusta resultat även vid jämförelsevis låg provstorlekar eftersom interindividuell och inter rättegång variabilitet delvis genomsnitt ut på grund av observationen av befolkningen över långa tidsperioder. Medan bunden flygning och löpband ger förmodligen guldmyntfoten om stimulans presentation och tidsupplösning, är arenor som används utformad för enskilda djur och det är därför tidskrävande att få urvalsstorlekar som krävs för en statistisk analys. Flera andra metoder har nyligen utvecklats som tillåter en effektiv förvärv av högupplösta beteendedata i kombination med en väl definierad stimulans regim. Dessa inkluderar oövervakad 3D-följning av flera vinäger flugor i en vindtunnel i kombination med en exakt 3D-modell av lukt plym ⁵ </sup>, spårning av flera individuella flugor i valet kammare levereras med luftströmmar från båda sidor ²⁵ och Flywalk paradigm ^26.

I Flywalk är 15 individuella flugor som ligger i små glasrör och kontinuerligt övervakas av en överliggande kameran i rött ljus. Lukter tillsätts till en kontinuerlig luftström av 20 cm / sek och färdas genom glasrören med en konstant hastighet. Luftströmmen fuktas genom att passera 250 ml flaskor innehållande destillerat vatten (luftfuktare) innan lukten leveranssystem. De flies' positioner redovisas i en kvadrat område av intresse (ROI) som omfattar större delen av längden av de lukt rör (men exklusive de yttre kanterna av rören (ungefär 5 mm vid varje sida) där flugorna inte kan röra sig ytterligare upp- eller medvind) runt tiden för lukt presentation (Figur 1A, B). Fly identiteter hålls konstant genom uppföljningssystemet throughout experimentet på grundval av deras Y-positioner (dvs. deras glasrörs gränser). Luktstimulering åstadkommes med användning av ett flerkomponent stimulans enhet som tillåter presentationen av upp till 8 enkel lukt och alla möjliga blandningar därav ^26,29 (Figur 1B). Förloppet för ett experiment styrs av en dator som reglerar lukt avgivningssystemet och samla temperatur och fuktighet information (dator 1, Figur 1C). Denna dator styr också en datalogger (start / stopp-inspelning) på en annan dator som kontinuerligt följer flyga befattningar i 20 bilder per sekund (dator 2). Fly positioner, lukt ventilstatus (dvs. tidspunkt ventilöppning), lukt ID, temperatur och luftfuktighet runt luktstimuleringscykler inloggad dator 2. På detta sätt information om lukt och flyga positioner är synkroniserade och exporteras som CSV-filer som kan ytterligare bearbetas och analyseras med hjälp av skräddarsydda skriftlig analysrutiner. Därför atthela systemet är datorstyrt, krävs ingen mänsklig inblandning under en experimentell session.

Protocol

Bygg- och tekniska detaljerna i Flywalk har beskrivits på annan plats 26 (vid eventuella problem att etablera detta inrättas, ytterligare information kan erhållas från MK). Här fokuserar vi på detaljerade instruktioner om hanteringen av paradigm som kommer att hjälpa att få tillförlitliga resultat. 1. Fly Hantering Bakre flyger i låga till medel kulturer densitet på mat mediet 27 enligt en 12 timmar: 12 timmar ljus: mörker regimen vid 23-25…

Representative Results

Eftersom flugor får distribuera fritt inom sina glasrör mellan luktpulser och odören pulsen färdas genom glasrören med en konstant hastighet flugor stöter odören vid olika tidpunkter beroende på deras x-positionen vid tidpunkten för stimulans. Som ett resultat, är de inträden i de motvindstyp banor framkallade av en 500 ms puls av en attraktiv 10 -3 utspädning av etylacetat fördröjd med ungefär en sekund för flugor på medvinds slutet av sin glasrör jämfört med dem av flugor som sitter när…

Discussion

Även om Flywalk systemet verkar ganska sofistikerade vid första anblicken, en gång ställa upp och köra det är lätt att använda och ger mycket robusta resultat. För att understryka överensstämmelsen mellan de resultat med bioanalys det kan sägas att de representativa resultat som visas här erhölls nästan 2 år efter några av de resultat som visas i en tidigare studie ²⁹ med en modifierad installation med en ny mjukvara och ljuskälla. Trots lock svaren är – trots något högre svars amplituder…

Materials

Flywalk setup	Custom		details available upon request
stimulus device	Custom		details available upon request
LED cluster	Custom		details available upon request
HD Pro Webcam C920	Logitech, Lausanne, Switzerland
2 Computers
Flywalk Reloaded v1.0 software	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Labview 11.0 software	National Instruments, Austin, TX
Standard fly food	Custom
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
aspirator	Custom
mineral oil	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
odors	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µl PCR reaction tubes	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany