Hoge-resolutie Kwantificering van Geur-begeleide Gedrag in<em> Drosophila melanogaster</em> Met behulp van de<em> Flywalk</em> Paradigm
Summary
De automatische tracking systeem Flywalk wordt gebruikt voor hoge-resolutie kwantificering van geur-begeleide gedrag de Drosophila melanogaster.
Abstract
In hun natuurlijke omgeving, insecten zoals de azijn Drosophila melanogaster worden gebombardeerd met een enorme hoeveelheid chemisch verschillende geurstoffen. Om de zaak nog verder te compliceren, de gedetecteerd door het insect zenuwstelsel geuren zijn meestal niet enkel verbindingen, maar mengsels waarvan de samenstelling en de concentratie ratio's variëren. Dit leidt tot een bijna oneindig aantal verschillende olfactorische stimuli die moeten worden geëvalueerd door het zenuwstelsel.
Om te begrijpen welke aspecten van een geur stimulus zijn bepalend voor de evaluatie door de vlieg, is het daarom wenselijk om efficiënt te onderzoeken geur geleid gedrag ten opzichte van vele geurstoffen en geur mengsels. Om direct correleren gedrag neuronale activiteit, moet het gedrag worden gekwantificeerd in een vergelijkbare tijd en onder dezelfde voorwaarden als stimulans in neurofysiologische experimenten. Echter, veel momenteel gebruikt olfactorische bioassays de Drosophila neuroethology nogal speciaseerd, hetzij in de richting van de efficiëntie of naar resolutie.
Flywalk, een geautomatiseerde geur levering en tracking systeem, overbrugt de kloof tussen efficiëntie en resolutie. Zij maakt de bepaling van precies wanneer een geur packet stimuleerde vrijlopende vlieg en de animal's bepalen dynamische gedragsreactie.
Introduction
Het overkoepelende doel van een neuroethological onderzoek is om een oorzakelijk verband tussen de activiteit staten van enkele neuronen of neuronale circuits en het gedrag van een organisme vast te stellen. Om dit doel te bereiken neuronale activiteit en het gedrag moeten worden gecontroleerd onder identieke stimulus omstandigheden en deze stimulans voorwaarden idealiter vergelijkbaar zijn met die van het zenuwstelsel onder de loep geëvolueerd om gevoel van te maken. Vooral als het gaat om gedragsverandering bioassays, hebben deze eisen in het verleden bewezen heel veeleisend de Drosophila melanogaster olfactorische neuroethology.
Eenmaal vrijgekomen uit de bron, geur pluimen snel breken in dunne filamenten met turbulente diffusie veroorzaakt door beweging van de lucht zijn de belangrijkste determinant van geur verdeling 1. Dientengevolge, een insect navigeren naar een geurbron ervaart intermitterende stimulatie met geur pakketten afgewisseld met variabele intervallen van schone lucht. Beidewandelen en vliegende insecten – met inbegrip van Drosophila – is aangetoond dat deze regeling intermitterende stimulatie voor navigatie misbruiken door stijgende upwind op pluim ontmoeting en overwegend bewegende cross-wind in de afwezigheid van geuren 2-5. Overwegende dat stimulatie procedures in fysiologische experimenten grotendeels lijken op die van een insect kunnen ervaren in de natuurlijke omgeving door ofwel het verstrekken van enkele trekjes van geuren afgewisseld met langere periodes van schone lucht of dynamische stimulatie sequenties 6-11, veel gedragsproblemen bioassays gebruikt in Drosophila neuroethology zoals val assay , open veld arena's of T-doolhof vertrouwen op geur-hellingen 12-15. Omdat geur hellingen per definitie variabele concentratie, afhankelijk van de afstand tot de geurbron een bepaald gedrag kan niet worden toegeschreven aan een nauwkeurige geurconcentratie via deze paradigma. Bovendien is de helling vaneen geur gradiënt kritisch afhangt van de fysisch-chemische eigenschappen van de geurstof. 20, hetgeen kan leiden tot een verkeerde interpretatie – Een gradiënt van een zeer vluchtige verbinding zullen ondieper dan door een minder vluchtige verbinding en dus ook moeilijker te sporen om een organisme te vertrouwen op het meten concentratieverschillen in ruimte als de enige navigatiemiddel 16 zijn olfactorische preferenties name keuze assays. Dit effect is ook zeer schadelijk is bij het onderzoek naar gedrag naar geur mengsels, omdat het leidt tot verschillende mengselcomponent verhoudingen op elk punt in de ruimte en dus opnieuw verzet tegen een duidelijke correlatie tussen de fysiologie en gedrag.
Terwijl azijn vliegt de neiging te aggregeren op het vergisten van fruit, ze zijn solitair in hun navigatie richting voedselbronnen en ovipositie sites. Niettemin plaats testen van individuele dieren vele gedragsparadigma's gebruikt in Drosophila neuroethology onderzoekt de geur geleid gedrag van cohorten van vliegen en aantrekkingskracht wordt gescoord als de fractie van vliegen het kiezen van de geur over een controle stimulus. Deze cohort experimenten hebben in belangrijke mate bijgedragen aan het begrip van fly neuroethology en veel van de opmerkingen van het gebruik van hen kon in single-fly experimenten worden bevestigd. Er is echter waargenomen dat vliegt kan elke other's beslissing 21 beïnvloeden en in het uiterste geval de evaluatie van een geur kan overschakelen van onverschilligheid voor het vermijden, afhankelijk van de bevolkingsdichtheid 22. Bovendien, de resultaten van dergelijke experimenten geven vaak slechts het eindpunt van een sequentie van gedrags- besluiten in plaats observeren wat vlieg doet terwijl het doet, hetgeen wenselijk is bij een poging om gedrag neuronale activiteit correleren. Deze vrij lage resolutie cohort experimenten worden in contrast met single-fly methoden met een hoge resolutie, zoals aangebonden vlucht arena's en loopbanden die het mogelijk makenvoor een directe observatie van gedragsreacties op het moment dat de stimulus wordt gepresenteerd 20,23,24. Toch cohort experimenten zijn nog steeds populair, omdat ze zijn zeer efficiënt en bieden robuuste resultaten, zelfs bij relatief lage steekproefomvang omdat inter-individuele en inter-proces variabiliteit gedeeltelijk uitgemiddeld als gevolg van de observatie van de bevolking gedurende langere perioden. Terwijl vastgebonden vlucht en loopband verschaffen waarschijnlijk de gouden standaard betreffende stimulus en temporele resolutie, worden de arena gebruikt voor eenmalig dieren en derhalve tijdrovend te verkrijgen steekproef noodzakelijk maten voor statistische analyse. Verscheidene andere benaderingen zijn recentelijk ontwikkeld dat een efficiënte acquisitie van hoge-resolutie gedragsgegevens in combinatie met een goed gedefinieerde stimulus regeling mogelijk maken. Deze omvatten zonder toezicht 3D-volgen van meerdere azijn vliegen in een windtunnel in combinatie met een nauwkeurige 3D-model van de geur pluim 5 </sup>, het bijhouden van meerdere afzonderlijke vliegen in keuze kamers met luchtstromen geleverd aan beide zijden 25 en de Flywalk paradigma 26.
In Flywalk, zijn 15 individuele vliegen gelegen in kleine glazen buisjes en continu bewaakt door een overhead camera onder rood licht. Geuren worden toegevoegd aan een continue luchtstroom van 20 cm / sec en reis door de glazen buizen met een constante snelheid. De luchtstroom wordt bevochtigd door het door 250 ml flessen met gedestilleerd water (luchtbevochtigers) voordat de geur afgiftesysteem. De flies' posities worden opgeslagen in een vierkant gebied van belang (ROI) omvat de meeste van de lengte van de geur buizen (met uitzondering van de buitenranden van de buizen (ongeveer 5 mm aan elke kant) wanneer de vliegen niet kan bewegen verder omhoog of wind) rond de tijd van geur presentatie (figuur 1A, B). Fly identiteiten worden constant gehouden door het volgsysteem throughout het experiment op basis van de Y-posities (gebruikte glazen buis grenzen). Geur stimulering wordt bereikt met een multi-component stimulus inrichting waarbij het voorleggen van maximaal 8 enkele geuren en alle mogelijke mengsels daarvan 26,29 (Figuur 1B) mogelijk maakt. Tijdens een proef wordt bestuurd door een computer regelen van de geur afgiftesysteem en het verzamelen van temperatuur en vochtigheid informatie (computer 1, figuur 1C). Deze computer stuurt ook een datalogger (start / stop opname) op een tweede computer die continu tracks vliegen posities bij 20 frames per seconde (computer 2). Vliegen posities, geur klep staat (dwz tijd-punt van de klep opening), geur ID, temperatuur en vochtigheid rond geur stimulatie cycli worden aangemeld bij de computer 2. Op deze manier informatie over de geur en vliegen posities worden gesynchroniseerd en geëxporteerd als CSV-bestanden die kunnen verder worden verwerkt en met behulp van aangepaste geschreven analyseroutines geanalyseerd. Omdathet hele systeem computergestuurd, zonder menselijke tussenkomst nodig tijdens een experimentele sessie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel de Flywalk systeem lijkt eerder verfijnd op het eerste gezicht, een keer up and running is het eenvoudig te gebruiken en levert zeer robuuste resultaten. Om de consistentie van het geproduceerde de bioassay resultaten wijzen kan worden gezegd dat de representatieve resultaten hier opgegeven waarden werden bijna 2 jaar na een aantal van de in een eerdere studie 29 met een gewijzigde opstelling met een nieuwe tracking software en lichtbron resultaten. Toch is de lokstof reacties zijn – ondanks de iets ho…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Daniel Veit voor technische bijstand en Pedro Gouveia bij Electricidade Em Pò (electricidadeempo.net) voor het aanpassen van de tracking software voor onze eisen. We danken ook Tom Retzke voor ondersteuning tijdens het filmen proces. Deze studie werd ondersteund door het Max Planck Society.
Materials
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
References
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor plumes and how insects use them. Annu. Rev. Entomol. 37, 505-532 (1992).
- Kennedy, J. S., Marsh, D. Pheromone-regulated anemotaxis in flying moths. Science. 184 (4140), 999-1001 (1974).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Exp. Biol. 209 (15), 3001-3017 (2006).
- Buehlmann, C., Graham, P., Hansson, B. S., Knaden, M. Desert ants locate food by combining high sensitivity to food odors with extensive crosswind runs. Curr. Biol. 24 (9), 960-964 (2014).
- Van Breugel, F., Dickinson, M. H. Plume-tracking behavior of flying Drosophila emerges from a set of distinct sensory-motor reflexes. Curr. Biol. 24 (3), 274-286 (2014).
- Schuckel, J., Meisner, S., Torkkeli, P. H., French, A. S. Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms. J. Comp. Physiol. A. 194 (5), 483-489 (2008).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural encoding of rapidly fluctuating odors. Neuron. 61 (4), 570-586 (2009).
- Nagel, K. I., Wilson, R. I. Biophysical mechanisms underlying olfactory receptor neuron dynamics. Nat. Neurosci. 14 (2), 208-216 (2011).
- Martelli, C., Carlson, J. R., Emonet, T. Intensity invariant dynamics and odor-specific latencies in olfactory receptor neuron response. J. Neurosci. 33 (15), 6285-6297 (2013).
- Szyszka, P., Gerkin, R. C., Galizia, C. G., Smith, B. H. High-speed odor transduction and pulse tracking by insect olfactory receptor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (47), 16925-16930 (2014).
- Nagel, K. I., Hong, E. J., Wilson, R. I. Synaptic and circuit mechanisms promoting broadband transmission of olfactory stimulus dynamics. Nat. Neurosci. 18 (1), 56-65 (2014).
- Larsson, M. C., Domingos, A. I., Jones, W. D., Chiappe, M. E., Amrein, H., Vosshall, L. B. Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron. 43 (5), 703-714 (2004).
- Knaden, M., Strutz, A., Ahsan, J., Sachse, S., Hansson, B. S. Spatial representation of odorant valence in an insect brain. Cell Rep. 1 (4), 392-399 (2012).
- Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A single-fly assay for foraging behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801 (2013).
- Farhan, A., Gulati, J., Groβe-Wilde, E., Vogel, H., Hansson, B. S., Knaden, M. The CCHamide 1 receptor modulates sensory perception and olfactory behavior in starved Drosophila. Sci. Rep. 3 (2765), 1-6 (2013).
- Flügge, C. Geruchliche Raumorientierung von Drosophila melanogaster. Z. Vgl. Physiol. 20 (4), 462-500 (1934).
- Borst, A., Heisenberg, M. Osmotropotaxis in Drosophila melanogaster. J. Comp. Physiol. A. 147 (4), 479-484 (1982).
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nat. Neurosci. 11 (2), 187-199 (2008).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nat. Commun. 2 (441), 1-10 (2011).
- Gaudry, Q., Hong, E. J., Kain, J., de Bivort, B. L., Wilson, R. I. Asymmetric neurotransmitter release enables rapid odour lateralization in Drosophila. Nature. 493 (7432), 42442-42448 (2013).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (3), 708-712 (1974).
- Ramdya, P., Lichocki, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2014).
- Bhandawat, V., Maimon, G., Dickinson, M. H., Wilson, R. I. Olfactory modulation of flight in Drosophila is sensitive, selective and rapid. J. Exp. Biol. 213 (21), 3625-3635 (2010).
- Duistermars, B. J., Chow, D. M., Frye, M. A. Flies require bilateral sensory input to track odor gradients in flight. Curr. Biol. 19 (15), 1301-1307 (2009).
- Claridge-Chang, A., Roorda, R. D., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Steck, K., Veit, D., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction – The Flywalk. Sci. Rep. 2 (361), 1-9 (2012).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosoph. Inf. Serv. 34, 117-118 (1960).
- Lebestky, T., Chang, J. S. C., et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron. 64, 522-536 (2009).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. Compound valence is conserved in binary odor mixtures in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 217 (20), 3645-3655 (2014).
- Olsson, S. B., Kuebler, L. S., et al. A novel multicomponent stimulus device for use in olfactory experiments. J. Neurosci. Meth. 195 (1), 1-9 (2011).
