Laser-capture microdissectie van Human Prostatic Epithelium voor RNA-analyse
Summary
The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
Abstract
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
Introduction
De prostaat is een heterogeen weefsel samengesteld uit secretoire epitheel gerangschikt in glandular acini omgeven door fibromusculaire stroma voornamelijk samengesteld uit gladde spieren 1. De epitheliale compartiment omvat vijf verschillende maar georganiseerde celtypes: basale cellen, secretorische cellen, neuro-endocriene cellen, transit versterken en stamcellen 2. Bij prostaatkanker (PCa), die voortvloeit uit de luminale epitheliale cellen, de groei van het adenocarcinoom veroorzaakt een duidelijke geleidelijke afname van het stromale compartiment 3. Daarom zullen weefselmonsters zijn duidelijke verschillen in het aandeel van stromale en epitheliale celtype gebaseerd op de mate van PCa. Deze verschillen kunnen leiden tot vertekende aannames van de genexpressie gegevens van hele weefsels verkregen ongeacht microdissectie van het gewenste celtype. Daarom, om deze bias te verwijderen is het noodzakelijk om celtypen te scheiden voorafgaand aan RNA-extractie engenexpressie analyse.
Macrodissection of microdissectie kan worden fysiek gescheiden goed gekarakteriseerde epitheliale delen van de omliggende stroma 4 -6. Macrodissection wordt meestal gedaan met een scheermesje onder een dissectiemicroscoop en werkt goed voor het scheiden van grote prostaatkanker knobbeltjes stroma, maar niet kan verwijderen goedaardige epitheel van omliggende stroma (zie voorbeeld goedaardige prostaat histologie in figuur 1). Microdissectie met een laser (LCM) aanzienlijk arbeidsintensiever dan macrodissection, maar kan zeer nauwkeurig ontleden goedaardige epitheel 4.
Recente publicaties van ons lab hebben aangetoond dat RNA met succes door de LCM van beide formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) biopten of bevroren weefsel 4,7-9 kan worden gewonnen. De belangrijkste uitdagingen in LCM-RNA-extractie zijn 1) om nauwkeurig ontleden de gewenste gebieden van het weefsel, en 2) te behouden RNA integriteit tijdens de LCM en isolatie proces 4,10. RNA geïsoleerd uit zuivere celpopulaties kunnen worden gebruikt voor genexpressieanalyse door verscheidene werkwijzen zoals reverse transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR) 7,8, microarray 11 en diep -sequencing 12-14.
Het doel van dit protocol is het totaal RNA van LCM prostaat epitheel isoleren uit bevroren weefsel op stroomafwaartse genexpressie analyses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genexpressie profilering van humane monsters kan lastig zijn, niet alleen voor de kwaliteit of kwantiteit van weefsel mogelijk, maar ook de verschillende zich in een bepaald weefsel specimen histologische entiteiten. Deze Vooral in de prostaat waarin goedaardige weefsels grotendeels stromale weefsels en delen van kanker zijn verstoken van stroma. LCM vergemakkelijkt fysieke scheiding van prostatische stroma en epitheel RNA een nauwkeuriger handtekening van de twee verschillende celtypen (Figuur 1A). In …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
Materials
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4,0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
References
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
- McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
- Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
- Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
- Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
- Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
- Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95 (2010).
- Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165 (2010).
- Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
- Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
- Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
- Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
- Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246 (2014).
