The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
Предстательная железа является гетерогенным ткани состоят из секреторного эпителия расположены в железистой ацинусов окружении фиброзно-мышечной стромы, состоящей в основном из гладких мышц 1. Эпителиальный отсек состоит из пяти разных, но организованных типов клеток: базальных клеток, клеток, секреции нейроэндокринных клеток, транзитные делящиеся клетки и стволовые клетки 2. При раке предстательной железы (РПЖ), который возникает из просвета эпителиальных клеток, рост аденокарциномы вызывает очевидный прогрессирующее снижение стромальных купе 3. По этим причинам, образцы ткани будет четкие различия в соотношении стромальных и эпителиальных клеток типа на основе степени РПЖ. Эти различия могут привести к необъективным предположений данных экспрессии генов, полученных из целых тканей без учета микродиссекции нужного типа клеток. Таким образом, чтобы удалить это смещение очень важно, чтобы отделить клеточные типы до экстракции РНК иАнализ экспрессии генов.
Macrodissection или микродиссекции могут быть использованы для физического отделения хорошо охарактеризованных эпителиальные области от окружающей стромы 4 -6. Macrodissection обычно делается с лезвием под микроскопом рассекает и работает хорошо для разделения большого РПЖ узелки из стромы, но не способен удалять доброкачественные эпителий от окружающих стромы (см пример доброкачественной гистологии простаты на рисунке 1). Микродиссекция с помощью лазера (LCM) является значительно более трудоемким, чем macrodissection, но может очень точно анализировать доброкачественной эпителия 4.
Последние публикации из нашей лаборатории показали, что РНК может быть успешно извлечены из LCM либо фиксированных формалином парафин (FFPE) биопсии или замороженной ткани 4,7-9. Основные проблемы в добыче LCM-РНК являются: 1) точно анализировать нужные участки ткани, и 2), чтобы сохранить RЦелостность Н.А. во время LCM и изоляция технологического 4,10. РНК, выделенной из клеток чистых популяций могут быть использованы для анализа экспрессии генов несколькими способами, включая обратной транскрипции количественной ПЦР (RT-КПЦР) 7,8, 11, микрочипов и глубокой характерны чередования 12-14.
Цель этого протокола заключается в изоляции общей РНК из LCM железы эпителия из замороженной ткани для выражения ниже по течению гена анализов.
Экспрессия генов профилирования из человеческих образцов может быть сложным, не только для качества или количества ткани доступной, но и для различных гистологических лиц, присутствующих в данной ткани образца. Это особенно сложно в простате, в котором доброкачественные ткани в значи…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
PEN-membrane 4,0 mm slides | Leica | 11600289 | |
Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |