Physische Isolierung von Endospores aus Umweltproben durch gezielte Lyse von vegetativen Zellen
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, ein Protokoll für die Abtrennung von bakteriellen Endosporen aus vegetativen Bakterienzellen in Umweltproben bereitzustellen. Die Bildung von bakteriellen Endosporen ist eine Überlebensstrategie, in der Regel durch Verhungern ausgelöst, in einer Anzahl von Bakteriengruppen zum Stamm Firmicutes 1 gehör gefunden. Endosporen-bildende Bakterien sind gut untersucht, vor allem, da eine Reihe von Stämmen sind Krankheitserreger und folglich der medizinischen Bedeutung (zB Bacillus anthracis oder Clostridium difficile). Umwelt Stämme von Endosporen-bildenden Bakterien wurden aus nahezu jedem Umfeld (Boden, Wasser, Sediment, Luft, Eis, menschlichen Darm, Tiere gut, und mehr) 1-3 isoliert. Daher sind Firmicutes das zweithäufigste Stamm in Stammsammlungen 4.
Wegen ihrer hardy äußeren Rinde und Schutzkernproteine können Endosporen extremen Umweltbedingungen im Bereich fr überlebenom Austrocknung zu hohe Strahlungs, extreme Temperaturen und schädliche Chemikalien 5. Diese bemerkenswerte Widerstandsfähigkeit macht es eine Herausforderung, DNA von Endosporen 6-8 extrahieren. Dies erklärt wahrscheinlich, warum sie in der Umweltsequenzierungsstudien 9,10 sehen worden. Andere Verfahren, wie die Zielrichtung Endosporen in Umweltproben durch fluoreszierende Antikörper 11, Quantifizierung von Dipicolinsäure (DPA) im Boden 12 und Sediment 13, Durchflusszytometrie 14 oder Pasteurisierung und anschließende Kultivierung 15,16 verwendet worden, um in abzurufen oder zu quantifizieren Endosporen Umweltproben. In den letzten Jahren optimierten DNA-Extraktionsverfahren als auch spezifische molekulare Primer zielen Endosporen spezifischer Gensequenzen wurden entwickelt 10,17-20. Dies hat dazu beigetragen, mehr Biodiversität in dieser Gruppe von Bakterien 21 offenbaren und hat sich auch auf Anwendungen in Industrie und Medizin zum Nachweis von Endosporen geführtZum Beispiel in Milchpulver 19.
Das hier vorgestellte Protokoll basiert auf dem Unterschied in der Beständigkeit gegenüber Schad physikochemischen Bedingungen (wie Wärme und Reinigungsmittel) von bakteriellen Endosporen verglichen mit Zellen, vegetativen basiert. Vegetativen Zellen in einer Probe zu zerstören wir nacheinander erhitzen, Lysozym und niedrigen Konzentrationen von Detergentien. Die Zeit und die Kraft dieser Behandlungen sind optimiert worden, um nicht-Sporen zu zerstören, sondern um alle vegetativen Zellen lysieren. Einige Zellen in einer Umweltzellpool sind widerstandsfähiger als andere, so, um die Wahrscheinlichkeit der Zerstörung aller vegetativen Zellen zu erhöhen, verwenden wir drei verschiedene Behandlungen. Der Vorteil und die Neuheit dieses Verfahrens ist, dass die Endosporen nach der Behandlung noch intakt und kann für weitere Downstream-Analysen verwendet werden. Dazu gehören DNA-Extraktion, quantitative PCR (qPCR) und Amplikon oder Metagenom-Sequenzierung (Targeting gezielt die Gruppe der Endosporen und damit Reduzierung diversity, bei gleichzeitiger Erhöhung Deckung). Die Endosporen könnte auch für die nachgeschalteten Anbau oder die Quantifizierung durch Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, Durchflusszytometrie oder Detektion von DPA. Ein wichtiges Merkmal dieses Verfahrens ist, dass durch Vergleichen eines unbehandelten Probe mit einer behandelten Probe, kann man die Menge und Vielfalt von Endosporen in einer Umweltprobe zusätzlich zu der Komponente, die Zellen vegetativen abzuleiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Widerstand der Endosporen externe aggressive physikochemische Faktoren (zB Temperatur oder Waschmittel) wurde verwendet, um ein Verfahren, um bakterielle Endosporen von vegetativen Zellen in Umweltproben getrennt entwickeln. Dies ist die erste umfassende Methode, um Endosporen aus Umweltproben in einem zerstörungsfrei zu isolieren. Früheren Methoden zu quantifizieren ist, nachzuweisen oder zu analysieren Endosporen Proben wurden über die Messung des spezifischen Proxies für Endosporen wie Dipicolinsäur…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem Schweizerischen Nationalfonds Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 und No. 151948 und Fundation Pierre Mercier Pour La Science.
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
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