Optimering av sår Scratch analys för att upptäcka förändringar i Murine Mesenkymala Stromal Cell Migration Efter Skador av lösliga cigarett rökextrakt
Summary
The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.
Abstract
Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.
Introduction
Cell migration är mycket samordnat och avgörande för många fysiologiska processer såsom vävnadsutveckling, reparation och förnyelse, samt patologiska processer såsom cancer metastaser och åderförkalkning 1. En förståelse av cellmigration är särskilt relevant för nya behandlingsmetoder som används för att reparera skadade vävnader och behandla patologiska tillstånd, inklusive celltransplantationsteknik och artificiell vävnad ympning 2. Med tanke på den aktuella i rollen av mesenkymala stromaceller (MSC) vid medievävnadsreparation 3, kvantifiera migrations kapaciteten hos dessa celler med användning av en analys som är strikt kvantifierbara, anpassningsbar och kostnadseffektiv är av intresse. Viktigt, måste en sådan analys är tillräckligt känsligt för att detektera relativt små förändringar i cellulär migrations kapacitet efter skador. Nuvarande metoder för att kvantifiera cellmigration, inklusive skrap analyser, trans brunnar migrationsanalyser (Boyden chbärnsten), mikropinne arrayer, och cellzonen analyser har en rad begränsningar i reproducerbarhet, anpassningsbarhet, kvantifiering och kostnadseffektivitet 1,4,5. Den optimerade scratch analys som beskrivs här visar robusta resultat, mätbara och bildbaserade analysfunktioner, kostnadseffektivitet och anpassningsförmåga till andra program.
Skrap analyser har använts i multipla förmågan att bedöma cellmigration och -proliferation under olika experimentella förhållanden 5. Analysen innebär sådd de utsedda cellerna, odla dem att komplettera eller nära sammanflödet, och repa resulterande monoskiktet med en steril nål eller pipettspets 6. Analys oftast utförs genom att jämföra bredden av repan över multipla tidpunkter på slumpvis valda ställen 7-9. Trots sin framträdande användning är scratch analysen förvirrad av problem med reproducerbarhet och kvantifiering. Variabilitet igenerering av repan inte bara förändrar mikromiljön av cellerna, men kan också hämma cellmigration genom att skada plattans yta och den underliggande extracellulär-matris 5. Analyser ofta genomförs över 7 till 12 timmar, men för cellinjer visar långsammare migration och längre analystider blir proliferation en confounding variabel 7,10. Slutligen, kan åldrande celler som genereras av skrapa processen frigöra faktorer som stör den extracellulära signaler som krävs för att överbrygga klyftan i monolagret 1. Optimera scratch analys kräver skapandet av en konsekvent lucka som inte interfererar med ytegenskaper, vilket minimerar analystid längd, och förhindra oönskad celldöd under manipulation. Proppen baserad analys är en optimering av en cellzonen analys. Denna analys utnyttjar en propp placerad i mitten av brunnen som utesluter celltillväxt, men tillåter celler som skall pläteras runt den centrala zonen.För att bedöma migrering, är proppen avlägsnas, och den resulterande zonen tillhandahåller en yta för migrering inträffa. Emellertid är denna analys svåra att anpassa eller anpassa 10 och för vissa tillämpningar, kan denna teknik också vara kostnadseffektivt oöverkomliga.
Till skillnad från scratch analyser och deras derivat, trans-brunn migrationsanalyser (eller Boyden kammaranalyser) bedöma migration genom att kvantifiera antalet celler som rör sig från en kammare, genom en mikrofiltermembran, i en kammare som innehåller kemotaktiska medel 8,11, 12. Denna teknik har begränsad användbarhet för vidhäftande celler såsom MSC: er eftersom följande migration genom det porösa membranet, celler vidhäftar till membransidan exponeras för de kemotaktiska medel och kan vara svårt att exakt kvantifiera. Medan analysen kan undersöka några tredimensionella migrationsmönster, de begränsade celltyper som det är möjligt att exakt kvantifiera begränsa cellmigration dess användbarhet 10. Ett annat alternativ till skrap analyser använder en mikro-pelare matris, som mäter cellulär motilitet genom en tre-dimensionell rymd med hjälp av förmågan hos celler att deformeras och migrera in i matrisen som ett surrogat. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomerer härdade över en exakt form och behandlades med ozon och fibronektin ger en homogen och icke-nedbrytbart mikromiljö. Mikro pelare avstånd kan också varieras efter behov för att mäta förmågan hos cellerna att gå in i arrayen 4. Formen skapas genom djup reaktiv jonetsning av kiselskivor för att skapa en negativ version av den höga bildkvot matrisen 13. Svårt att skapa mikro pelaren arrayer, medan analysen förstärks genom sin anpassningsförmåga, förmåga att modellera tredimensionella migration och analyser genom direkt visualisering av migrerande celler, förhindrar ekonomiskt dess utbredda användning.
Den optimerade scratch analys som beskrivs i detta protokoll ger en effektiv, cost-effektiv metod för att framställa konsekventa repor som kan analyseras med hjälp av fritt tillgänglig programvara. I stället för enkla bredd mätningar som gjorts över repan före och efter cellmigration, programvaran gör det möjligt för användaren att bestämma den totala skrapområden före och efter migreringen. Denna utveckling begränsar frågan om att försöka avgöra var scratch mätningarna bredd bör vidtas, och om bredden på scratch är likformig utmed dess längd. Dessutom är noggrann optimering av cellantal, cellsammanflödet och typ samt graden av skadorna på cellerna diskuteras i syfte att ytterligare optimera analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här ger en kvantitativt robust, standardiserad metod för att genomföra och analysera skrap analyser. Enkla skrap analyser används rutinmässigt inom många olika områden i studien att undersöka cellulära migration. Men traditionellt scratch analysen har saknat en standardiserad uppsättning upp och kvantifiering protokoll, vilket har lett till problem med reproducerbarhet 7,10. Många av de ändringar och optimeringar för att förbättra scratch analysen har minskat dessa frå…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.
Materials
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healting plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
