Оптимизация раны царапинам анализе для обнаружения изменений в мышиной мезенхимальных стромальных клеток миграции после повреждения по растворимый экстракт сигаретного дыма
Summary
The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.
Abstract
Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.
Introduction
Миграция клеток высоко скоординированных и жизненно важное значение для многих физиологических процессах, таких как развитие тканей, ремонта и регенерации, а также патологических процессов, таких как метастазирование рака и атеросклероза 1. Понимание миграции клеток, в частности, отношение к возникающим лечения, используемых для восстановления поврежденных тканей и лечения патологических состояний, в том числе клеточной трансплантации и искусственных технологий ткани прививки 2. Учитывая текущую заинтересованность в роли мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в опосредовании тканей ремонт 3, количественной миграционную способность этих клеток с помощью анализа, который строго количественно, адаптации, и экономически эффективным представляет интерес. Важно отметить, что подобный анализ должен быть достаточно чувствительным, чтобы обнаружить относительно небольшие изменения в клеточной миграции емкости после повреждения. Современные методы количественной оценки миграции клеток, в том числе скретч-анализы, анализы миграции транс-а (Бойден чянтарь), micropillar массивы, и анализы клеточной зоны отчуждения обладают ряд ограничений в воспроизводимости, возможности настройки, количественного и экономической эффективности 1,4,5. Оптимизированная царапины анализа, описанного здесь демонстрирует устойчивые результаты, поддающиеся количественной оценке и на основе образа возможности анализа, рентабельность и адаптируемость к другим приложениям.
Царапины анализы были использованы в нескольких емкостей для оценки миграции клеток и пролиферации при различных экспериментальных условиях 5. Анализ влечет за собой посева назначенных клетки, растет их полное или почти полное слияние, и царапин полученной монослой стерильной иглой или кончиком пипетки 6. Анализ наиболее часто выполняется путем сравнения ширины царапины над различные моменты времени в случайно выбранных местах 7-9. Несмотря на видном использования, царапины Анализ посрамлены проблем с воспроизводимостью и количественного определения. Изменчивостьпоколение нуля не только изменяет микроокружение клеток, но также может препятствовать миграции клеток, повреждая поверхности пластины и основной внеклеточный матрикс-5. Анализы часто проводились в течение 7 до 12 часов, однако для клеточных линий отображаются медленнее и дольше миграции раз анализ, распространение становится сбивающий переменной 7,10. Наконец, стареющие клетки, созданные в процессе царапин может выпустить факторы, которые мешают внеклеточной сигнализации требуется, чтобы закрыть разрыв в монослое 1. Оптимизация царапинам анализа требует создания постоянной щели, чтобы не мешать с поверхностными свойствами, минимизируя длительность анализа и предупреждения нежелательной клеточной гибели во время манипуляции. Пробка на основе анализа является оптимизация зоны анализа клеток исключения. Этот анализ используют пробку помещают в середине скважины, что исключает рост клеток, но позволяет клеткам быть покрыты вокруг центральной зоны отчуждения.Для оценки миграции, стопор снимается, и полученный в результате зона отчуждения обеспечивает поверхность для миграции происходит. Тем не менее, этот анализ сложно настроить или адаптировать 10 и для некоторых приложений, этот метод также может быть сопряжено с запретом.
В отличие от нуля анализов и их производных, миграции и транс-анализов (или Бойдена камеры анализов) оценки миграции путем количественного определения количества клеток, которые перемещаются из одной камеры, через микропористой мембраны фильтра, в камеру, содержащую хемотаксические агентов 8,11, 12. Эта техника имеет ограниченную полезность по адгезивных клеток, таких как МСК, так как следующие миграции через пористую мембрану, клетки прилипать к стороне мембраны воздействию хемотаксиса агентов, и может быть трудно точно измерить. В то время как анализ способен исследовать некоторые трехмерные модели миграции, ограниченные типы клеток, для которых она способна точно определить их миграции клеток ограничивают ее полезность 10, Еще одной альтернативой нуля анализов использует массив микро-столб, который измеряет сотовой моторику через трехмерном пространстве с помощью способность клеток к деформации и мигрируют в массив в качестве суррогата. Polydimethlysiloxane (PDMS) эластомеры вылечить более точного форму и обрабатывают озоном и фибронектин производит однородную и неразлагаемую микросреду. Расстояние между микро-колонна также может изменяться по мере необходимости, чтобы оценить способность клеток, чтобы войти в массив 4. Форма создается с помощью глубокой реактивного ионного травления кремниевых пластин для создания отрицательного версию высокого удлинения массива 13. В то время как анализ подкрепляется его настраиваемость, возможность моделировать трехмерную миграцию и анализ через прямой визуализации мигрирующих клеток, трудности в создании микро-столба массивы экономически препятствует его широкому использованию.
Оптимизированная царапины анализа, описанного в этом протоколе обеспечивает эффективное, созт эффективное Способ получения в соответствии царапины, которые могут быть проанализированы с использованием свободно доступного программного обеспечения. Вместо простых измерений ширины по всей нуля до и после миграции клеток, программное обеспечение позволяет пользователю определить общей площади царапины до и после миграции. Это продвижение ограничивает вопрос, пытаясь определить, где царапина ширина измерения должны быть приняты, и будет ли ширина царапины однородно вдоль его длины. Кроме того, тщательное оптимизацию количества клеток, клеток слияния и типа и степени ущерба, нанесенного клеток обсуждается в целях дальнейшей оптимизации анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, обеспечивает надежную количественно, стандартизированный метод для выполнения и анализа скретч анализов. Простые скретч анализы, которые обычно используются во многих различных областях исследования для изучения клеточной миграции. Тем не менее, традицион…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.
Materials
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healting plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
