La cartographie du génome à l'échelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine)

Résumé

Identifier les cibles directes de molécules du génome ciblage reste un défi majeur. Pour comprendre comment les molécules de liaison à l'ADN engagent le génome, nous avons développé une méthode qui repose sur la réticulation de petites molécules à isoler la chromatine (COSMIC).

Résumé

Le génome est la cible de certains agents chimiothérapeutiques les plus efficaces, mais la plupart de ces médicaments manquer de spécificité de séquence d'ADN, ce qui conduit à la dose-limitant la toxicité et d'effets secondaires indésirables. Le ciblage du génome de petites molécules spécifiques de séquence peut permettre molécules ayant un indice thérapeutique accru et moins d'effets hors cible. -methylpyrrole N / N -méthylimidazole polyamides sont des molécules qui peuvent être rationnellement conçus pour cibler des séquences d'ADN spécifiques avec précision exquise. Et contrairement à la plupart des facteurs de transcription naturels, les polyamides peuvent se lier à l'ADN méthylé et chromatinized sans perte d'affinité. La spécificité de séquence de polyamides a été largement étudié in vitro avec l'identification du site apparenté (CSI) et avec des approches biochimiques et biophysiques traditionnels, mais l'étude de polyamide se lier à des cibles génomiques dans les cellules reste insaisissable. Nous rapportons ici une méthode, la réticulation de petites molécules pour Isolate chromatine (COSMIC), qui identifie les sites de liaison de polyamide à travers le génome. Cosmique est similaire à immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), mais diffère de deux manières importantes: (1) un photoréticulant est utilisé pour permettre sélectif capture, temporellement contrôlée par des événements de liaison de polyamide, et (2) la poignée d'affinité de la biotine est utilisée pour purifier le polyamide -ADN conjugués dans des conditions semi-dénaturantes pour diminuer l'ADN qui est lié de manière non covalente. Cosmique est une stratégie générale qui peut être utilisée pour faire apparaître les événements de liaison du génome entier de polyamides et d'autres agents chimiothérapeutiques du génome de ciblage.

Introduction

Les informations de rendre chaque cellule dans le corps humain est codé dans l'ADN. L'utilisation sélective de l'information régit le destin d'une cellule. Les facteurs de transcription (TF) sont des protéines qui se lient à des séquences spécifiques d'ADN pour exprimer un sous-ensemble particulier de gènes dans le génome, et le mauvais fonctionnement de TFS est liée à l'apparition d'un large éventail de maladies, y compris les défauts de développement, le cancer et le diabète . ^1,2 Nous avons été intéressés par le développement de molécules qui peuvent se lier sélectivement à la génomique et de moduler les réseaux de régulation....

Protocole

1. La réticulation dans des cellules vivantes

1. Commencer par 2,5x10 ~ ⁷ cellules H1, ​​ou d'autres cellules en culture.
   NOTE: Ce nombre de cellules H1 correspond à cinq plats de 10 cm (environ 40% de confluence).
2. Produire des cellules dans E8 médias sur des plats revêtus sur une surface qui soutient les cellules souches pluripotentes (voir list des matériaux) et les incuber à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO _2. Cellules de récolte enzymatique (voir liste matériaux). Remarque: Ne laissez pas les cellules de H1 à dépasser 90% de confluence; confluence induit la différenciation spontanée des cellules ....

Résultats

Pour tenir compte des non-uniforme génome fragmentation et d'autres variables, l'ADN purifié doit toujours être normalisé contre une référence de l'ADN d'entrée. Des amorces spécifiques à un locus d'intérêt peuvent être utilisés. Il est utile d'analyser aussi un lieu où ne devrait pas se lier à la molécule, en tant que témoin négatif. Nous voyons une augmentation de> 100 fois en occupation polyamide lors de l'irradiation avec de la lumière de 365 nm (Figure 2).

Discussion

L’un des principaux défis de la ChIP conventionnelle est l’identification d’anticorps appropriés. La ChIP dépend fortement de la qualité de l’anticorps, et la plupart des anticorps commerciaux sont inacceptables pour la ChIP. En fait, le consortium ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) a constaté que seulement 20 % des anticorps commerciaux convenaient aux tests ChIP. ⁵⁰ Avec COSMIC, les anticorps sont remplacés par la streptavidine. Parce que les polyamides sont fonctionnalisés avec de la biotine, la streptav.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)	toute source
Benzamidine	toute source
Pepstatine	toute source
Protéinase K	toute source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies	65001
PBS, pH 7,4	Life Technologies	10010-023	D’autres sources peuvent être utilisées
: StemPro Accutase, Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Nous avons essayé d’autres fabricants de colonnes d’ADN avec succès.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit	Illumina	IP-202-1012	Ce kit peut être utilisé pour préparer l’ADN COSMIQUE pour le séquençage de nouvelle génération
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Biosciences	356231	Utilisé pour revêtir des plaques afin de cultiver H1 ESCs
Papier	toute source
Tubes de microcentrifugation ambrés	N’importe quelle source
Tubes de microcentrifugation	toute source
filtre pyrex	toute source		plats de cuisson en pyrex sont adaptés
qPCR master mix	toute source
RNase	toute source
HCl (6 N)	toute source
Boîtes de culture tissulaire de 10 cm	toute source
Pipettes sérologiques	toute source
Pipettes Pasteur	toute source
Pointes de pipette	n’importe quelle source
Tubes coniques de 15 ml	toute source
Centrifugeuse	toute source
Microcentrifugeuse	n’importe quelle source
Nutator	n’importe quelle source
Magnétique rack de séparation	toute source
Source UV	CalSun	B001BH0A1A	D’autres sources UV peuvent être utilisées, mais le temps de réticulation doit être optimisé empiriquement
Sonicateur Misonix	Qsonica	S4000 avec corne de tasse 431C1	D’autres sonicateurs peuvent être utilisés, mais les conditions de sonication doivent être optimisées empiriquement
Incubateur CO2 humidifié	toute source
Enceinte de sécurité biologique avec sortie de vide	toute source

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