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Biologie

La cartographie du génome à l'échelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine)

Published: January 20, 2016
doi:
10.3791/53510
, , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering,University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology,University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center,University of Wisconsin–Madison

Summary

Identifier les cibles directes de molécules du génome ciblage reste un défi majeur. Pour comprendre comment les molécules de liaison à l'ADN engagent le génome, nous avons développé une méthode qui repose sur la réticulation de petites molécules à isoler la chromatine (COSMIC).

Abstract

Le génome est la cible de certains agents chimiothérapeutiques les plus efficaces, mais la plupart de ces médicaments manquer de spécificité de séquence d'ADN, ce qui conduit à la dose-limitant la toxicité et d'effets secondaires indésirables. Le ciblage du génome de petites molécules spécifiques de séquence peut permettre molécules ayant un indice thérapeutique accru et moins d'effets hors cible. -methylpyrrole N / N -méthylimidazole polyamides sont des molécules qui peuvent être rationnellement conçus pour cibler des séquences d'ADN spécifiques avec précision exquise. Et contrairement à la plupart des facteurs de transcription naturels, les polyamides peuvent se lier à l'ADN méthylé et chromatinized sans perte d'affinité. La spécificité de séquence de polyamides a été largement étudié in vitro avec l'identification du site apparenté (CSI) et avec des approches biochimiques et biophysiques traditionnels, mais l'étude de polyamide se lier à des cibles génomiques dans les cellules reste insaisissable. Nous rapportons ici une méthode, la réticulation de petites molécules pour Isolate chromatine (COSMIC), qui identifie les sites de liaison de polyamide à travers le génome. Cosmique est similaire à immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), mais diffère de deux manières importantes: (1) un photoréticulant est utilisé pour permettre sélectif capture, temporellement contrôlée par des événements de liaison de polyamide, et (2) la poignée d'affinité de la biotine est utilisée pour purifier le polyamide -ADN conjugués dans des conditions semi-dénaturantes pour diminuer l'ADN qui est lié de manière non covalente. Cosmique est une stratégie générale qui peut être utilisée pour faire apparaître les événements de liaison du génome entier de polyamides et d'autres agents chimiothérapeutiques du génome de ciblage.

Introduction

Les informations de rendre chaque cellule dans le corps humain est codé dans l'ADN. L'utilisation sélective de l'information régit le destin d'une cellule. Les facteurs de transcription (TF) sont des protéines qui se lient à des séquences spécifiques d'ADN pour exprimer un sous-ensemble particulier de gènes dans le génome, et le mauvais fonctionnement de TFS est liée à l'apparition d'un large éventail de maladies, y compris les défauts de développement, le cancer et le diabète . 1,2 Nous avons été intéressés par le développement de molécules qui peuvent se lier sélectivement à la génomique et de moduler les réseaux de régulation génétique.

Polyamides composés de N et N -méthylimidazole -methylpyrrole sont des molécules qui peuvent cibler l'ADN avec des spécificités et des affinités que les facteurs de transcription naturels rival. 3-6 Ces molécules se lient à des séquences spécifiques dans le sillon de l'ADN conçu rationnellement. 4,5,7 -11 polyamides ont été employées à la fois réprimer et activer l'expression de g spécifiqueEnes. 4,12-19 Ils ont aussi intéressants antiviraux et anticancéreux 20-24 12,13,25-30 propriétés. Une caractéristique intéressante de polyamides est leur capacité à accéder à des séquences d'ADN qui sont méthylés 31,32 et enroulé autour de protéines histones 9,10,33.

Pour mesurer les spécificités de liaison complets de molécules de liaison à l'ADN, notre laboratoire a créé la méthode apparentée identifiant du site (CSI). 34-39 L'apparition prévue de sites de liaison basées sur des spécificités (genomescapes) in vitro peuvent être affichées sur le génome, parce que la in vitro intensités de liaison sont directement proportionnelles à constantes d'association (K a). 34,35,37 Ces genomescapes donnent un aperçu de polyamide occupation à travers le génome, mais polyamide mesurant la liaison dans les cellules vivantes a été un défi. ADN est bien emballé dans le noyau, ce qui pourrait influer sur l'accessibilité des sites de liaison. Le Accessibilité de ces séquences d'ADN chromatinized à polyamides reste un mystère.

Récemment, de nombreuses méthodes pour étudier les interactions entre les petites molécules et les acides nucléiques ont émergé. 40-48 La capture d'affinité chimique et séquençage de l'ADN massivement parallèle (chem-SEQ) est une telle technique. Chem-seq utilise le formaldehyde pour réticuler petites molécules sur une cible génomique d'intérêt et un dérivé biotinylé d'une petite molécule d'intérêt à capter l'interaction ligand-cible. 48,49

Formaldéhyde réticulation conduit à des interactions indirectes qui peuvent produire des faux positifs. 50 Nous avons développé une nouvelle méthode, la réticulation de petites molécules d'isoler la chromatine (COSMIC), 51 avec un photoréticulant pour éliminer ces soi-disant pics "fantômes". 50 Pour commencer, nous avons conçu et synthétisé des dérivés trifonctionnels de polyamides. Ces molécules contenaient une pol de liaison à l'ADNyamide, un photoréticulant (psoralène), et une poignée d'affinité (biotine, figure 1). Avec polyamides trifonctionnels, on peut de manière covalente capturer interactions polyamide-ADN avec 365 nm irradiation UV, une longueur d'onde qui ne nuit pas à l'ADN ou l'induit non-psoralène à base de reticulation. 51 Ensuite, on fragmente le génome et purifier l'ADN capturé sous stricte, semi -denaturing conditions pour diminuer l'ADN qui est lié de manière non covalente. Ainsi, nous considérons cosmique comme une méthode liée à Chem-seq, mais avec une lecture plus directe de l'ADN de ciblage. Fait important, la faible (K 10 3 -10 4 M -1) affinité pour l'ADN de psoralène ne pas détectable incidence polyamide spécificité. 51,52 Les fragments d'ADN peuvent être analysés enrichies soit par polymérase quantitative réaction en chaîne 51 (COSMIC-qPCR) ou par séquençage de prochaine génération 53 (COSMIC-seq). Ces données permettent une conception impartiale, génome guidée de ligands qui entreagir avec leur loci génomiques désiré et minimiser les effets hors-cible.

Figure 1
Figure 1. polyamides bioactifs et plan cosmique. Épingle à cheveux (A) les polyamides 1-2 cible la séquence d'ADN 5'-WACGTW-3 '. Polyamides linéaires 3 – 4 cibles 5'-AAGAAGAAG-3 '. Anneaux de N-méthylimidazole sont en gras pour plus de clarté. Les cercles vides et pleins représentent N et N -méthylimidazole -methylpyrrole, respectivement. Place représente 3-chlorothiophène, et les diamants représentent β-alanine. Psoralène et la biotine sont désignés par P et B, respectivement. (B) plan cosmique. Les cellules sont traitées avec les dérivés trifonctionnels de polyamides. Après réticulation par irradiation UV à 365 nm, les cellules sont lADN génomique et ysed est cisaillée. Des billes magnétiques revêtues de streptavidine sont ajoutées à saisir des produits d'addition polyamide-ADN. L'ADN est libéré et peut être analysé par PCR quantitative (qPCR) ou par séquençage de prochaine génération (NGS). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

1. La réticulation dans des cellules vivantes Commencer par 2,5×10 ~ 7 cellules H1, ​​ou d'autres cellules en culture. NOTE: Ce nombre de cellules H1 correspond à cinq plats de 10 cm (environ 40% de confluence). Produire des cellules dans E8 médias sur des plats revêtus sur une surface qui soutient les cellules souches pluripotentes (voir list des matériaux) et les incuber à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Cellules de récolte enzyma…

Representative Results

Pour tenir compte des non-uniforme génome fragmentation et d'autres variables, l'ADN purifié doit toujours être normalisé contre une référence de l'ADN d'entrée. Des amorces spécifiques à un locus d'intérêt peuvent être utilisés. Il est utile d'analyser aussi un lieu où ne devrait pas se lier à la molécule, en tant que témoin négatif. Nous voyons une augmentation de> 100 fois en occupation polyamide lors de l'irradiation avec de la lumière de 365 nm (Figure 2).</…

Discussion

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H. I. Romnes faculty fellowship, and the W. M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

Materials

Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-mL conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source
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Keywords: Genome-wide MappingDrug-DNA InteractionsCOSMICCrosslinkingSmall MoleculesChromatinPolyamidesDNA-targetingMechanism Of ActionTherapeutic AgentsDNA-targeting MoleculesPluripotent Stem CellsPhoto-cross-linkingUV RadiationCell DissociationEnzymeE8 Media
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Citer Cet Article
Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).
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