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Biologie

COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

Published: January 20, 2016
doi:
10.3791/53510
, , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering,University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology,University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center,University of Wisconsin–Madison

Summary

게놈 대상 분자의 직접적인 목표를 확인하는 것은 중요한 과제로 남아. DNA 결합 분자 게놈 참여 방법을 이해하기 위해, 우리는 염색질을 분리하는 작은 분자의 가교에 의존하는 방법 (COSMIC)을 개발.

Abstract

게놈은 가장 효과적인 화학 요법 제의 일부의 목표이지만, 이러한 약물의 대부분은 투여 량 – 제한 독성 많은 부작용을 초래 DNA 서열 특이성을 결여. 서열 – 특이 소분자와 게놈 타겟팅 증가 된 치료 지수 적은 표적 이탈 효과 분자를 가능하게 할 수있다. N의 -methylpyrrole / N -methylimidazole 아미드 합리적 절묘한 정밀도로 특정 DNA 서열을 대상으로 설계 될 수 분자이다. 그리고 가장 자연스러운 전사 인자와는 달리, 폴리 아미드는 친 화성의 손실없이 메틸화 및 chromatinized DNA에 결합 할 수 있습니다. 폴리 아미드의 서열 특이도는 광범위하게 동족 사이트 식별 (CSI)와 체외에서 전통적인 생화학 및 생물 물리학 적 방법으로 연구되어 왔지만, 세포의 게놈 대상에 결합 폴리 아미드의 연구는 애매 남아있다. 우리는 방법을보고 여기서, 작은 분자의 가교하는 졸라테 염색질 (COSMIC은), 즉 게놈에 걸쳐 폴리 아미드 결합 부위를 식별합니다. COSMIC는 염색질 면역 (칩)와 유사하지만, 두 가지 중요한 방식에서 차이 : photocrosslinker은 선택적, 시간적으로 제어되는 아미드 결합 이벤트 캡처, 및 (2) 비오틴 친화력 핸들 아미드를 정화하는 데 사용을 가능하게하는데 사용된다 (1) 반 변성 조건에서 -DNA 복합체가 아닌 공유 결합 인 DNA를 감소시킵니다. COSMIC는 폴리 아미드 및 다른 게놈 표적 항암제의 게놈 전체의 결합 이벤트를 나타 내기 위해 사용될 수있는 일반적인 전략이다.

Introduction

정보는 인간의 몸에있는 각 셀은 DNA로 인코딩하게한다. 정보의 선택적 사용은 세포의 운명을 관장. 전사 인자 (TFS)의 게놈에서 유전자의 특정 서브 세트를 표현하는 특정 DNA 서열에 결합하는 단백질이고, TF가의 오동작 발육 불량, 암, 당뇨병을 포함한 질병의 광범위한 배열의 발병에 연결되어 . 1, 우리는 선택적으로 유전자에 결합하여 유전자 조절 네트워크를 조절할 수 분자를 개발에 관심이 있었다.

폴리 아미드는 N 개의 -methylpyrrole 구성 및 N 라이벌 자연 전사 인자. 3-6이 분자가 DNA의 작은 홈에 특정 서열에 결합 특이성과 친화력을 가진 DNA를 타겟팅 할 수 있습니다 분자를 -methylimidazole 합리적으로 설계되어있다. 4,5,7 -11 폴리 아미드를 모두 억제하는데 사용될 특정 g의 발현을 활성화 된ENES. 4,12-19은 또한 흥미 20-24 항 바이러스 및 항암 12,13,25-30 특성을 갖는다. 폴리 아미드의 하나의 매력적인 기능은 (31, 32)을 메틸화와 히스톤 단백질 9,10,33 감싸되는 DNA 서열에 액세스 할 수있는 능력이다.

DNA 결합 분자의 광범위한 결합 특이성을 측정하기 위해, 우리의 실험은 34-39 체외 특이성 (genomescapes)에 기초하여 결합 부위의 예측 된 발생 게놈 상에 표시 될 수있다. 동족 사이트 식별자 (CSI)에있어서 생성하기 때문에 체외에서 결합 강도가 협회 상수에 직접적으로 비례한다 (K). 34,35,37이 genomescapes는 게놈에서 폴리 아미드 점유율에 대한 통찰력을 제공하지만, 살아있는 세포에 결합 측정 폴리 아미드 도전하고있다. DNA는 단단히 결합 부위의 접근성에 영향을 미칠 수있는 핵에 포장된다.폴리 아미드 이러한 chromatinized DNA 서열의 ccessibility은 신비에 남아있다.

최근, 많은 방법이 등장 작은 분자와 핵산 사이의 상호 작용을 연구. 40-48을 화학적 친 화성 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 (화학-서열은) 하나의 기술이다. 화학 – 서열은 리간드 – 타겟 상호 작용을 캡쳐하는 관심 대상 유전자와 명소 소분자의 비오틴 유도체 작은 분자를 가교하는 포름 알데히드를 사용한다. 48,49

포름 알데히드 가교는 오탐 (false positive)을 생성 할 수 있습니다 간접적 인 상호 작용에 연결됩니다. (50) 우리는 새로운 방법, 작은 분자의 가교이 소위 "팬텀"피크를 제거하기 위해 photocrosslinker와 염색질 (COSMIC), (51)을 분리한다. (50)을 시작하려면를 개발, 우리는 설계 및 폴리 아미드의 관능 성 유도체를 합성. 이들 분자는 DNA 결합 POL 포함yamide, photocrosslinker (소 랄렌)과 친 화성 핸들 (비오틴, 그림 1). 관능 폴리 아미드, 우리는 공유. 365 nm의 자외선 조사, DNA 손상되거나 비 랄렌 계 가교를 유발하지 않는 파장을 갖는 폴리 DNA 상호 작용을 캡처 (51) 다음으로, 우리는 엄격한 반 하에서 캡처 DNA를 게놈 단편화 및 정제 -denaturing 조건이 아닌 공유 결합 인 DNA를 감소시킵니다. 따라서, 우리는 화학-SEQ 관련된 방법으로서 COSMIC 볼하지만 DNA의 직접적인 판독 타겟팅. 중요한 것은, 약한 (K 10 세 -10 4 M-1) DNA에 대한 소 랄렌의 친화력은하지 않습니다, 검출 충격 폴리 아미드 특이성. (51, 52) 농축 DNA 절편이 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (51) 중 하나에 의해 분석 될 수있다 (COSMIC-qPCR에) 또는 차세대 시퀀싱 (53) (COSMIC-SEQ)에 의해. 이러한 데이터는 리간드의 편견, 게놈 안내 디자인을 사용하는 것이 간자신의 원하는 게놈 궤적 행동 및 오프 – 타겟 효과를 최소화 할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 생리 활성 폴리 아미드 및 COSMIC 계획. (A) 폴리 아미드 머리핀 (가) 1 – 2 타겟 DNA 서열 5'-WACGTW-3 '. 선형 폴리 아미드 3-4 목표 5'-AAGAAGAAG-3 '. N 메틸이 미다 졸의 반지는 명확성을 위해 굵은있다. 열고 채워진 원은 각각 N 개의 -methylpyrrole 및 N의 -methylimidazole을 나타냅니다. 스퀘어 -3- 클로로 티를 나타내고, 다이아몬드 β 알라닌을 나타낸다. 소 랄렌 및 비오틴은 각각 P 및 B로 표시된다. (B) COSMIC 계획. 세포는 폴리 아미드의 관능 성 유도체로 처리됩니다. 365 nm의 자외선을 조사하여 가교 한 후, 세포는 L 아르ysed 및 게놈 DNA는 전단된다. 스트렙 타비 딘 – 코팅 자석 구슬은 폴리 아미드-DNA 부가 물을 캡처하는 추가됩니다. DNA가 해제되고 정량 PCR (qPCR에) 또는 차세대 시퀀싱 (NGS)에 의해 분석 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

라이브 세포 1. 가교 ~에 웰당 2.5 7 H1 세포, 또는 다른 배양 세포로 시작합니다. 참고 : H1 셀이 숫자는 5 ~ 10 cm의 요리 (약 40 % 컨 플루)에 해당합니다. 다 능성 줄기 세포를지지하는 표면 상에 코팅 접시에 E8 배지에서 세포를 성장 (자재 목록 참조), 및 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 37 ° C에서 그들을 부화. 수확 세포는 효소 (자료 목록 참조). 참고 : H1 세포가 90 % ?…

Representative Results

불균일 게놈 단편화 및 다른 변수를 고려하기 위해, 정제 된 DNA는 항상 입력 DNA의 기준에 대해 표준화되어야한다. 관심의 궤적에 특이 적 프라이머를 사용할 수있다. 또한, 음성 대조군으로서, 분자가 결합 할 것으로 예상되지 않은 궤적을 분석하는데 도움이된다. 우리는 365 nm의 빛 (그림 2) 조사에 폴리 아미드 점유율에서> 100 배 증가를 참조하십시오. 농축 된 …

Discussion

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H. I. Romnes faculty fellowship, and the W. M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

Materials

Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-mL conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source
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References

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Keywords: Genome-wide MappingDrug-DNA InteractionsCOSMICCrosslinkingSmall MoleculesChromatinPolyamidesDNA-targetingMechanism Of ActionTherapeutic AgentsDNA-targeting MoleculesPluripotent Stem CellsPhoto-cross-linkingUV RadiationCell DissociationEnzymeE8 Media
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Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).
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