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Biologie

Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)

Published: January 20, 2016
doi:
10.3791/53510
, , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering,University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology,University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center,University of Wisconsin–Madison

Summary

La identificación de los blancos directos de moléculas del genoma de metas sigue siendo un reto importante. Para entender cómo las moléculas de unión al ADN involucran el genoma, hemos desarrollado un método que se basa en la reticulación de moléculas pequeñas para aislar la cromatina (cósmica).

Abstract

El genoma es el objetivo de algunos de los agentes quimioterapéuticos más eficaces, pero la mayoría de estos fármacos carecen de especificidad de secuencia de ADN, que conduce a la toxicidad limitante de la dosis y muchos efectos secundarios adversos. Targeting el genoma con pequeñas moléculas específicas de secuencia puede permitir moléculas con el aumento del índice terapéutico y menos efectos fuera de objetivo. -methylpyrrole N / N poliamidas metilimidazol son moléculas que pueden ser racionalmente diseñados para dirigir las secuencias de ADN específicas con exquisita precisión. Y a diferencia de la mayoría de los factores de transcripción naturales, poliamidas pueden unirse al ADN metilado y cromatinizados sin una pérdida en la afinidad. La especificidad de secuencia de poliamidas ha sido ampliamente estudiado in vitro con la identificación del emplazamiento cognado (CSI) y con los enfoques bioquímicos y biofísicos tradicionales, pero el estudio de poliamida unión a dianas genómicas en las células sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí mostramos un método, la reticulación de moléculas pequeñas a Isolate cromatina (cósmica), que identifica los sitios de unión de poliamida en todo el genoma. Cósmico es similar a inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), pero difiere en dos aspectos importantes: (1) un fotoentrecruzador se emplea para permitir la captura selectiva, controlada temporalmente de eventos de unión de poliamida, y (2) el asa de afinidad biotina se utiliza para purificar poliamida conjugados -ADN en condiciones semi-desnaturalizante para disminuir ADN que es no covalentemente. Cósmico es una estrategia general que puede ser utilizado para revelar los eventos de unión en todo el genoma de poliamidas y otros agentes quimioterapéuticos del genoma de metas.

Introduction

La información para hacer cada célula en el cuerpo humano está codificado en el ADN. El uso selectivo de la información que gobierna el destino de una célula. Los factores de transcripción (TFS) son proteínas que se unen a secuencias específicas de ADN para expresar un subconjunto particular de los genes en el genoma, y ​​el mal funcionamiento de TFS está vinculada a la aparición de una amplia gama de enfermedades, incluyendo defectos de desarrollo, el cáncer y la diabetes 1,2. Hemos estado interesados ​​en el desarrollo de moléculas que pueden unirse selectivamente al genoma y modular las redes de regulación de genes.

Poliamidas compuestos de N -methylpyrrole y N metilimidazol son moléculas que pueden diana de ADN con especificidades y afinidades que los factores de transcripción naturales rivales. 3-6 Estas moléculas se unen a secuencias específicas en el surco menor del ADN racionalmente diseñados. 4,5,7 -11 Las poliamidas se han empleado tanto para reprimir y activar la expresión de g específicaenes. 4,12-19 También tienen interesantes antivirales 20-24 y anticancerígenas 12,13,25-30 propiedades. Una característica atractiva de poliamidas es su capacidad para acceder a secuencias de ADN que están metilados 31,32 y envuelven alrededor de las proteínas histonas 9,10,33.

Para medir las especificidades de unión integrales de moléculas de unión al ADN, nuestro laboratorio creó el método de identificador de sitio de reconocimiento (CSI). 34-39 La aparición prevista de sitios de unión basado en in vitro especificidades (genomescapes) se puede visualizar en el genoma, ya que el in vitro intensidades de unión son directamente proporcionales a las constantes de asociación (K a). 34,35,37 Estos genomescapes proporcionan información sobre la ocupación de poliamida en todo el genoma, pero poliamida medir la unión en células vivas ha sido un reto. ADN está estrechamente empaquetado en el núcleo, que podría influir en la accesibilidad de los sitios de unión. La Accesibilidad de estas secuencias de ADN cromatinizados a poliamidas sigue siendo un misterio.

Recientemente, muchos métodos para estudiar las interacciones entre pequeñas moléculas y ácidos nucleicos han surgido. 40-48 La captura por afinidad química y la secuenciación del ADN masivamente paralelo (chem-ss) es una de estas técnicas. Chem-ss utiliza formaldehído para reticular moléculas pequeñas a una diana genómica de interés y un derivado biotinilado de una pequeña molécula de interés para capturar la interacción ligando-diana. 48,49

Reticulación formaldehído conduce a interacciones indirectas que pueden producir falsos positivos. 50 Hemos desarrollado un nuevo método, la reticulación de moléculas pequeñas para aislar la cromatina (cósmica), 51 con un fotoentrecruzador para eliminar estos llamados picos "fantasma". 50 Para empezar, hemos diseñado y sintetizado derivados trifuncionales de poliamidas. Estas moléculas contienen una pol unión al ADNyamide, un fotoentrecruzador (psoraleno), y un asa de afinidad (biotina, Figura 1). Con poliamidas trifuncionales, podemos capturar covalentemente interacciones de ADN de poliamida con irradiación UV 365 nm, una longitud de onda que no daña el ADN o inducir no psoraleno-basado de reticulación. 51 A continuación, fragmentar el genoma y purificar el ADN capturado bajo estrictas, semi condiciones -denaturing para disminuir ADN que es no covalentemente. Por lo tanto, visión cósmica como un método relacionado con chem-SEQ, pero con una lectura más directa de ADN de direccionamiento. Es importante destacar que los débiles (K a 10 3 -10 4 M -1) afinidad de psoraleno para el ADN no detectable de poliamida de impacto especificidad. 51,52 Los fragmentos de ADN enriquecidos pueden ser analizados por cualquiera de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa 51 (COSMIC-qPCR) o mediante la secuenciación de próxima generación 53 (COSMIC-ss). Estos datos permiten un diseño imparcial genoma guiada de ligandos que entreactuar con sus loci genómica deseada y minimizar los efectos fuera de objetivo.

Figura 1
Figura 1. poliamidas bioactivos y esquema cósmico. (A) poliamidas horquilla 1-2 diana la secuencia de ADN 5'-WACGTW-3 '. Poliamidas lineales 3 – 4 diana 5'-AAGAAGAAG-3 '. Anillos de N-metilimidazol están en negrita para mayor claridad. Los círculos vacíos y llenos representan N -methylpyrrole y N metilimidazol, respectivamente. Plaza representa 3-clorotiofeno y diamantes representan β-alanina. Psoralen y la biotina se denotan por P y B, respectivamente. (B) esquema cósmico. Las células se tratan con derivados trifuncionales de poliamidas. Después de la reticulación con 365 nm de la irradiación UV, las células son lse corta ADN genómico y ysed. Se añaden perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina para capturar aductos de ADN-poliamida. El ADN se libera y puede ser analizado mediante PCR cuantitativa (qPCR) o mediante la secuenciación de próxima generación (NGS). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. La reticulación en células vivas Comience con ~ 2.5×10 7 células H1, ​​u otras células cultivadas. NOTA: Este número de células H1 corresponde a cinco platos de 10 cm (aproximadamente 40% de confluencia). Cultivar las células en medios E8 en placas revestidas en una superficie que soporta las células madre pluripotentes (ver Lista de Materiales), y se incuba a 37 ° C en ambiente humidificado del 5% de CO 2. Células Cosecha enzimáticamente (ver Lista de …

Representative Results

Para tener en cuenta la fragmentación del genoma no uniforme y otras variables, el ADN purificado siempre debe ser normalizado contra una referencia de ADN de entrada. Los cebadores específicos de un locus de interés pueden ser utilizados. Es útil también para analizar un locus donde no se espera que la molécula para unirse, como un control negativo. Vemos un incremento> 100 veces en la ocupación de poliamida tras la irradiación con luz de 365 nm (Figura 2). Enriq…

Discussion

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.50 With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the Ansari lab and Prof. Parameswaran Ramanathan for helpful discussions. This work was supported by NIH grants CA133508 and HL099773, the H. I. Romnes faculty fellowship, and the W. M. Keck Medical Research Award to A.Z.A. G.S.E. was supported by a Peterson Fellowship from the Department of Biochemistry and Molecular Biosciences Training Grant NIH T32 GM07215. A.E. was supported by the Morgridge Graduate Fellowship and the Stem Cell and Regenerative Medicine Center Fellowship, and D.B. was supported by the NSEC grant from NSF.

Materials

Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-mL conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source
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Keywords: Genome-wide MappingDrug-DNA InteractionsCOSMICCrosslinkingSmall MoleculesChromatinPolyamidesDNA-targetingMechanism Of ActionTherapeutic AgentsDNA-targeting MoleculesPluripotent Stem CellsPhoto-cross-linkingUV RadiationCell DissociationEnzymeE8 Media
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Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).
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