Introduction
真獣類の妊娠中の栄養物、ガス及び老廃物の交換は、胎盤によって媒介されます。女性の生殖器官で、子宮動脈は子宮への血液の主な導管があります。注入後、専門の船にこれらのブランチは、胎児胎盤ユニットに向かって基底脱落膜を介してコイルらせん動脈と呼ばれます。直径特に子宮ナチュラルキラー（UNK）細胞では、白血球に囲まれているこれらのらせん動脈の弾力性は、胎盤1,2にボリュームと利用可能な血液の速度を決定します。らせん動脈のリモデリングの結果として正しいの血行動態の変化は、妊娠の成功のために重要です。
根底にあるメカニズムは、ヒトおよびマウスの妊娠の間に細部では異なるが、両種におけるリモデリングプロセスの最終結果は、平滑筋層を失う拡張、高コンダクタンスの血管系です。マウスでは、UNK細胞由来インターフェロン（IFN-）γは、妊娠中期3-5付近でこれらの変化を誘導することが必要です。 NK細胞またはIFN-γシグナル伝達経路の成分のいずれかを欠くマウスは、これらの変更を受けることができず、これは、胎児胎盤部に十分な血液供給の重要性を強調し、低減胎児成長6,7に関連しています。初期の人間の妊娠中、間質および血管内絨毛外栄養膜の浸潤およびUNK細胞との相互作用は、血管の変化を誘導し、胎児の成長の8-10を促進するために重要です。コロニー刺激因子（GM-CSF）12 - UNK細胞は、ケモカイン11と、このような顆粒球マクロファージなどのサイトカインを介して人間の栄養膜の浸潤を調整することができます。浅い栄養膜浸潤は、子癇前症9に低減動脈リモデリングと妊娠合併症に関連付けられています。
このプロトコルは、重要な記述アンクロイの先駆的な研究に基づいています免疫組織化学とエレガントな転送実験5,13を介して、成功した血管リモデリングのための免疫系、特にNK由来のIFN-γの役割。ここでは、らせん動脈の改造の状態を評価するための迅速かつ経済的な方法を説明します。私たちの研究室は、日常的に妊娠中期（妊娠日（GD）9.5）14でこれを評価しますが、リモデリングプロセスはgd8.5 12.5 15との間で行われます。自動スライドスキャナーの登場は、大いにセクションから血管内腔面積の評価を容易にした、我々は、これは血管の直径を測定するよりもより再現性のアプローチであることが判明します。 SMAの免疫組織化学的検出の添加は立体評価から得られた結果の簡単な検証を可能にします。すべての立体的な技術と同様に、それは、少なくとも2つの審査官に目がくらんで実験として評価を実施することをお勧めします。この目的のために、ランダム化ステップは連続的に切断する際に導入することができますティンサンプルスライドを評価する研究者は、試料が来る実験どのグループから知っているしないように。
このプロトコルの全体的な目的は、妊娠関連の合併症のためのマウスモデルの文脈において、慎重に定義された母体および父系の遺伝子型を有するマウスにおいて、らせん動脈のリモデリングを評価するための信頼できるツールを提供することにあります。結果は正常な胎児の成長のために不可欠である、このプロセスのUNK細胞への依存を強調しています。
Protocol
この原稿で説明するすべての手順は、英国内務省の規制に従っているとケンブリッジ倫理審査パネルによって承認されています。
1.検体採取
- 午後には（男性につき2人の女性まで）成人男性で8〜12週齢の雌のC57BL / 6マウスを用い時限交配を設定します。次の日に早朝に交尾の印として膣栓の存在を確認してください。午前中にプラグの存在はgd0.5をマーク。
- gd9.5で、頚椎脱臼により動物を安楽死させると、腹腔を開きます。 CO 2によって安楽死は、血管拡張を引き起こす可能性があることに注意してください。
- 静かに子宮動脈（ 図1、破線の矢印）を連結するためにデンタルフロスを使用してください。子宮頸部の周りだけでなく、卵巣に各子宮角、近位の先端に動脈周囲にフロスを接続します。
注意：これは崩壊した動脈をもたらすことができるように血管を破裂しないでください。 <李は>子宮角と子宮頸部の先端にある3つの連結点に遠位全体子宮を切除、解剖ハサミを使用してすぐに子宮を解剖します。 - 両方の角が子宮頸部から反対方向に同じ長軸に沿って整列されるように準備されたポリスチレン片に子宮を置きます。静かにそれを伸ばし、2-3、25G針を用いて、所定の位置にピン。
- 準備50mlコニカルチューブにポリスチレンを浸し。 10％ホルマリンで50 mlまでトップ。室温で5-6時間、固定してください。
- ホルマリン溶液を捨て、5分間50mlで1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を交換してください。
- 各末端での連結点に近位に2子宮角を切除し、近位中央に子宮頸部に、移植部位の周りの余分な脂肪を切り取るとホルマリンの痕跡を除去するために5分間PBSで2回洗浄します。
- 処理まで4℃（最大2週間）で、70％エタノール中のサンプルを保管してください。
注意：Ethとノールは非常に可燃性です。 - 表1に示すパラメータを使用して自動処理システムを使用する。これらは、子宮の長軸に垂直な平面に沿って切断することができるように、パラフィン中に個別に角を埋め込 みます。これは、各移植部位の最大面積は、ブロック（ 図2A）の中央に分析のために露出されることを保証します。
オプション：必要に応じて、これは、ブロックのランダム化のための便利な時点です。 - ミクロトームを使用して、ブロックから7ミクロンの厚さの連続切片を切りました。ヘマトキシリンおよびエオシンを持つすべての49μmの間隔で一つのセクションを染色（H＆Eは、2.1節を参照）。 SMA染色および他のダウンストリームアプリケーションのための室温で残りのセクションを保管してください。
| 溶液 | 時間 | 温度 |
| 70％エタノール | 1時間 | 40°C |
| 100％エタノール | 1時間 | 40°C |
| 100％エタノール | 1時間 | 40°C |
| 100％エタノール | 1時間 | 40°C |
| 100％エタノール | 1時間 | 40°C |
| 100％エタノール | 1時間 | 40°C |
| 100％エタノール | 1時間 | 40°C |
| 1時間 | 40°C | |
| キシレン | 1時間 | 40°C |
| キシレン | 1時間 | 40°C |
| パラフィン | 1時間 | 63°C |
| パラフィン | 1時間 | 63°C |
| パラフィン | 1時間 | 63°C |
| パラフィン | 1時間 | 63°C |
表1：子宮組織の処理のために使用される設定の自動化組織処理の設定の概要
2. STEReological評価
- H＆E染色
- 室温で10分間、100％キシレン浴にスライドラックに搭載されたスライドを浸漬することによって脱パラフィン切片。
注意：キシレンは可燃性であり、接触や吸入による毒性が疑われる発がん性物質。この作品は、個人用保護具（PPE）を使用して、ドラフト内で行わなければなりません。 - さらに10分間きれいなキシレンを含む浴中にスライドを浸し。
- 順次に5分ごとに100％エタノール、95％エタノール、70％エタノールおよび精製水を含む浴にスライドを浸します。
- 5分間、精製水で希釈し、50％ギル無3ヘマトキシリン溶液中でスライドを浸します。
注意：ヘマトキシリンは、経口摂取や目に接触すると有害です。取り扱う場合は、適切なPPEを着用してください。 - 10分間水道水の下で染色トラフでスライドを洗浄します。
- 10秒間、1％の酸/アルコール溶液（70％エタノール中の1％〜10 M塩酸）中でスライドを浸し水道流水で染色トラフで洗います。
- 30秒間エオジン液にスライドを浸し、10分間水道水の下で染色トラフで洗います。
- 換気フード内で、連続して5分ごとに70％エタノール、95％エタノールおよび100％エタノールを含有する浴中にスライドを浸します。
- 10分間キシレンを含む浴中にスライドを浸し。
- マウントは、キシレン系封入剤を使用してカバースリップ。顕微鏡下でスライドを可視化する前にヒュームフード内で水平にし、十分に乾燥させます。
- 室温で10分間、100％キシレン浴にスライドラックに搭載されたスライドを浸漬することによって脱パラフィン切片。
- 容器のサイズとリフォームの状態の立体評価
- 各移植部位については、正中矢状点に近接したセクションを決定します。胎児と胎盤の開発の間の漿尿取り付けは正中矢状点の良い指標となります。
- 分析のための正中矢状点に近い49μmの間隔で3つのセクションを選択します。選択したスライドをスキャンします。 INCを避けるためにより末梢移植部位16に位置することが示されているluding静脈は、各移植部位（ 図2A）の中央の2/4に分析を制限します。
- 内腔のサイズを評価するために、血管の内側の周りに描画し、この形の面積を記録します。総血管サイズのために、内皮細胞、周皮細胞および学内の白血球を含む、血管の外壁を中心に描きます。
注意：ルーメンの総血管サイズの比率は、血管の改造ステータスのプロキシです。血管がセクションに沿って切断した面を介してコイルのように、一のスライドに同じ動脈の複数の断面があるかもしれません。同じ動脈を複数回測定することは避けてください。 - 最大かつroundestルーメンで、各移植部位の5隻からの測定値を記録します。三重の各移植部位を（の3つのセクションでは、49ミクロン互いに離間）を測定します。これらの15の測定値のrepreseの平均最大の血管の平均直径をNTS。
- いくつかのサンプルで、より大きな血管の過剰発現を避けるために、各移植部位における血管の同じ数を測定します。
免疫組織化学を使用した定性的評価
- 脱パラフィンおよび再水和
- 室温で10分間、100％キシレン浴に耐熱スライドラックに搭載されたスライドを浸漬することによって脱パラフィン切片。
- さらに10分間きれいなキシレンを含む浴中にスライドを浸し。
- 順次に5分ごとに100％エタノール、95％エタノールおよび70％精製水を含有する浴中でスライドを浸します。
- 抗原回復
- 精製水中の10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液を調製し、10 M塩酸を用いてpHを6に調整します。
- 十分なワットを含む国内の圧力鍋で400ミリリットルのクエン酸ナトリウム緩衝液と場所で600ミリリットルを保持できる耐熱容器を満たしますerは、容器の半分を沈めました。緩く沸騰するまで圧力鍋と熱のふたを取り付けます。
- 場所スライドラックをクエン酸ナトリウム緩衝液中にしっかりと圧力鍋の蓋を固定します。加圧された後、3分間沸騰することができます。
- 圧力鍋を減圧し、内側容器を取り外します。スライドを室温で10分間クエン酸ナトリウム緩衝液中で冷却します。
- 洗浄は、5分間の精製水を含む浴中にスライドします。
- 疎水性バリアペンを使用してセクションを取り囲みます。
- 5分間PBSに浸漬することによって、スライドを洗浄します。
- 内因性ペルオキシダーゼをブロックし、非特異的結合
- 室温で30分間加湿チャンバー内に精製水で希釈した3％過酸化水素で切片をインキュベートします。
注意：過酸化水素は、皮膚や摂取時、目に非常に刺激性です。適切なPPEを着用してください。 - 過剰の過酸化水素溶液をオフにタップして、SLI洗いますDESは二回トリスに浸すことにより、2分ごとに、生理食塩水（TBS）をバッファリング。
- マウス免疫グロブリンを、製造業者の説明書に従って調製し、マウスキットのマウスからのブロッキング試薬で切片をインキュベートします。
- 洗浄は2分間ずつ二回、TBSでスライドします。
- 室温で30分間加湿チャンバー内に精製水で希釈した3％過酸化水素で切片をインキュベートします。
- 平滑筋アクチンの免疫検出
- （キットに付属）抗体希釈液を調製し、室温で5分間、切片とインキュベート、または製造業者の指示に従って。
- 1希釈：抗体希釈液中の100マウス抗ヒト平滑筋アクチン（DAKO M0851）。最終免疫グロブリン濃度は、両方のソリューションで同等であることを確認して、抗体の希釈液にマウスIgG2aアイソタイプコントロールを希釈します。
- 希釈した抗体またはアイソタイプコントロールソリューションのいずれかで過剰な抗体希釈液とカバーセクションをオフにタップします。室温で30分間加湿チャンバー内でインキュベートします。
- ウォッシュはのためにTBSで二回スライドします各2分。
- ビオチン化抗マウス二次抗体を希釈し、室温で10分間、切片をインキュベートし、または製造業者の指示に従って。
- ウォッシュは、それぞれ2分間、TBS、PBSで一回、各スライドします。
- 製造元の指示に従って、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）溶液を調製します。 DAB溶液で切片をカバーし、最大4分間インキュベートし、過剰な発色を回避するために、セクションを監視するように保証します。
注意：DABは可燃性であり、接触や吸入による毒性が疑われる発がん性物質。取り扱う場合は、適切なPPEを着用してください。 - 染色の所望の強度に達すると精製水にスライドを浸し。
- 20秒間50％のギル号3ヘマトキシリンで対比染色し、水が透明になるまで実行される水道水の下で染色トラフで洗います。
- 脱水および取り付け
- ヒュームフードの中で、順次70％のETHを含む浴中にスライドを浸しますノール、95％エタノールで5分間ずつ100％エタノール。
- 10分間キシレンを含む浴中にスライドを浸し。
- マウントは、キシレン系封入剤を使用してカバースリップ。顕微鏡下でスライドを可視化する前にヒュームフード内で水平にし、十分に乾燥させ
Representative Results
RAG2 - / - IL2RG - / -マウスは、NK細胞17を含むすべての成熟したリンパ球を欠いており、それらの子宮動脈は、妊娠中期5,14の周りにコンジェニック野生型C57BL / 6（WT）マウスで見られる血管の変化を受けることができません。 - / - IL2RG -この減少改造RAG2の結果/ -マウスは、H＆E染色切片で可視化した （図2）stereologically定量することができる全体の小型船を示す、著しく小さい管腔表面領域を示しています。また、（ルーメン比容器）の相対的な壁の厚さは、血液供給の減少およびより高い血流速度を示唆し、これらのマウスにおけるらせん動脈が高いです。
この定量的な評価は、SMAの免疫組織化学的検出を用いて確認しました。 WTマウスは、血管内のメディアSMAの大部分を失うことが特徴であります妊娠中期によるらせん動脈の。このNK細胞駆動プロセスが行われていない場合、SMAは、容器の培地中に残存し、容易に血管の周りのリング（ 図3）のような免疫組織化学的に検出することができます。
図1：gd9.5でのマウスの子宮、子宮角、子宮頸部（青）の相対的な位置を示す概略図の描画とメイン子宮動脈（赤）。子宮角（矢印）および連結点（破線の矢印）の長軸がある示しました。免疫組織化学のためのセクションでは、ビューの平面に沿って切断されています。
図2：妊娠中期での動脈リモデリングの立体的評価（A）の例ASSE。基底脱落膜の中央2/4における管腔およびWT女性からのH＆E染色切片上の総血管領域のssment gd9.5で（黒い縦により区画は、破線）。高倍率での船舶では、赤のラインは、総血管面積を画定する破線、黄色破線は、管腔面積を画定します。バー= 500μmの（左）、50ミクロン（右）。子宮の長軸がこの方向で水平線です。 WT（C57BL / 6）とRAG2からの総血管面積（右パネル）に管腔領域（左パネル）および管腔面積の割合の（B）の定量- / - IL2RG - / - マウス（C57BL / 6バックグラウンド上）。各データ点は、15の測定値（切片当たり5回の測定、移植部位につき3切片）の平均を表します。バーは群あたりn = 4妊娠11から13の移植部位の平均であり;両側、不対マンホイットニー検定のp値。 WT：野生型。
図3：基底脱落膜における平滑筋アクチンの免疫組織化学的検出 WT（上）とRAG2の代表SMA染色- / - IL2RG - / - gd9.5で（C57BL / 6バックグラウンド上、下）マウス。バー=100μmです。 WT：野生型。
Discussion
ここに提示されたプロトコルは、妊娠の成功のために必要な血管の変化を評価することにより、再現性のある方法を提供するように設計されています。この評価の成功のための重要な組織切片の品質です。正確に移植部位の妊娠期間を決定するだけでなく、確実に子宮動脈を結紮どちらも非常に重要なステップです。等の固定の時間、組織処理プロトコル、等のパラメータの変化も結果に影響を与え得ます。公平な立体評価のためには、各移植部位における血管の同じ数を測定することが重要です。これは、移植部位と三重の各移植部位あたり5隻を測定することをお勧めします。これらの15の測定値の平均が5最大血管の平均サイズを表します。
- / - IL2RG - / -さらにalymphoid RAG2からデータをここに示したマウスは、このprotのを見つけました阻害したNK細胞14のいずれかを含む不適切な母体の免疫機能のモデル数のocol便利。動脈リモデリングの欠陥はまた、障害の栄養膜浸潤18のモデルで示されており、ここに記載された技術は、これらの場合に、血管系を評価することが有益であり得ます。我々は、最適化、検証、このプロトコルをマウスで妊娠中期に脱落膜血管リモデリングの調査のために、それは他のモデル系（例えばラット）で、あるいは他の臓器で動作するように、このプロトコルを適応させることも考えられます。我々は、NK依存リモデリングがロバストgd9.5で評価することができることがわかりますが、このような母体血管系が完全に改造されgd12.5、などの他の時点のために改正することができます。この時点で、血管内栄養膜浸潤は16より深くであり、この時点では血管の変化のために、栄養膜の役割の調査のために、より適切であり得ます。追加の量的な読み出しが必要な場合は、研究者らはまた、SMAのために染色した切片の数を増やし、各移植部位内で部分的に改造船の割合を評価することができます。
このプロトコルの制限は、組織学的検査の記述的な性質です。機能アッセイは、しかし、ゆっくりとしか（例えばドップラー超音波19として）利用可能になってきています。これらの技術は、機器を取得し、維持するための技術的な専門知識とはるかに高い費用が必要ですが、組織学的に観察することができ、変更の影響をin vivoでの読み出しの縦を提供するという利点を有します。すべての立体検査の可能な欠点は、研究者の主観です。この目的を達成するために、独立して、すべてのサンプルを分析する二つの独立した審査官を使用すると、この問題を回避するのに役立ちます。ここで概説したプロトコルは多くの血液が胎児母体の界面に到達することができる方法への洞察を与えるが、それはCOMPLとそれを組み合わせることが有利であり得ますプラスチックを通して血管系における任意の時点で血液の総量を評価するementaryアプローチは、16をキャスト 。
このプロトコルの強度は、2つの独立したアプローチを組み合わせることです。血管の変化は、最初の定量的立体学によって評価され、その結果は、免疫組織化学を用いて定性的に検証されます。結果の信頼性をさらにサンプルをランダム化することによって強化することができます。このプロトコルのために調製された試料は、容易に厳密に妊娠中期での妊娠の表現型を評価するために、そのような目的の細胞のdecidualisation、妊娠のmesometrialリンパ集合（MLAp）の開発や免疫などの妊娠の他のパラメータを調査するために使用することができます。
動脈リモデリングは女性で合併症のない妊娠のための重要なステップであり、これらの変更の失敗は偉大な産科症候群（GOS）、すなわち、子癇前症、胎児の成長制限を支えると死産。ここでは、慎重にGOSの病態生理のいくつかの特性を模倣するマウスモデルにおける妊娠表現型を評価するための手法を提示します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25 G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
References
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