The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.
Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.
الغلوتامات هو ناقل عصبي مثير رئيسيا في شبكية العين 1. خلايا الشبكية العقدة (RGCs)، وتلقي مدخلات متشابك glutamatergic من خلايا القطبين 2، هي الخلايا العصبية الناتج من شبكية العين التي ترسل المعلومات البصرية إلى الدماغ. وأظهرت الدراسات الفسيولوجية التي الإثارة متشابك من RGCs وتتوسط postsynaptically بواسطة مستقبلات NMDA (NMDARs) ومستقبلات أمبا (AMPARs) 3،4،5. وعلى الرغم من توسط التيارات بعد المشبكي مثير (EPSCs) في RGCs بواسطة AMPARs وNMDARs 3،5،6،7،8، عفوية EPSCs مصغرة (mEPSCs) على RGCs يحمل فقط عنصرا بوساطة AMPARs-4،5،9. ومع ذلك، والحد من امتصاص الغلوتامات كشف عنصرا NMDAR في EPSCs عفوية 5، مما يشير إلى أن NMDARs على التشعبات RGC قد تكون موجودة خارج نقاط الاشتباك العصبي مثير. تحركات guanylate غشاء المرتبطة (MAGUKs) مثل PSD-95 أن مستقبلات الناقل العصبي العنقودية، بما في ذلك مستقبلات الغلوتامات والقناة الايونيةالصورة في مواقع متشابك، أيضا يحمل متميزة أنماط التعبير تحت المشبك 10،11،12،13،14.
وعلى مدى العقود الأخيرة، المناعية مبائر وقبل تضمين المجهر الإلكتروني (EM) المناعية المستخدمة لدراسة التعبير مستقبلات الغشاء. على الرغم من أن المناعية متحد البؤر يكشف أنماط واسعة من التعبير مستقبلات، أقل قرارها يجعل من المستحيل استخدامها لتمييز موقع التحت خلوية. وتشير تضمين مسبقة الدراسات EM في شبكية العين الثدييات أن مفارز NMDAR موجودة في العناصر بعد المشبكي في مخروط القطبين نقاط الاشتباك العصبي خلية الشريط 15،16،17. هذا هو على النقيض الواضح على الأدلة الفسيولوجية. ومع ذلك، نشر ناتج التفاعل هو قطعة أثرية معروفة في طريقة المناعي قبل التضمين. وبالتالي، فإن هذا النهج لا تعطي عادة بيانات موثوقة إحصائيا وقد تستبعد التمييز بين التعريب لغشاء متشابك مقابل 18،19،20،21 غشاء extrasynaptic. علىمن ناحية أخرى، البيانات الفسيولوجية والتشريحية تتفق مع التعريب متشابك من AMPARs على RGCs 3،5،7،9،22. وبالتالي، يتم ترجمة مستقبلات الغلوتامات وMAGUKs في المشبك الشريط شبكية العين ليس فقط على بعد المشبكي ولكن أيضا لالمقصورات غشاء perisynaptic أو extrasynaptic. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة إلى تحليل كمي عالية الدقة من هذه البروتينات الغشاء في المشبك الشريط في شبكية العين.
هنا، قمنا بتطوير تقنية postembedding EM immunogold لدراسة توطين تحت المشبك من مفارز NMDAR، مفارز AMPAR وPSD-95 تليها تقدير عدد وكثافة وتنوع هذه البروتينات في نقاط الاشتباك العصبي على RGCs الفئران المعنون باسم باستخدام الكوليرا السم الوحيدات ب (CTB) طرق تتبع الوراء.
وصفناها أربع تقنيات لنجاح الكمي بعد تضمين immunogold م: 1) تثبيت القصير والضعيف، 2) تجميد الاستبدال، 3) بعد دمج تلطيخ immunogold، و 4) الكمي.
EM immunogold يسمح للكشف عن بروتينات معينة في قطاعات النسيج سامسونج. الأجسام المضادة المسمى مع جزيئات الذهب …
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل برامج جماعية من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) والمعهد الوطني للاضطرابات التواصل الأخرى الصمم و(NIDCD)، من المعاهد الوطنية للصحة (NIH). نشكر منشأة NINDS EM وNIDCD متقدمة الأساسية التصوير (رمز # شركة زيورخ للتأمين العاصمة 000081-03) للحصول على المساعدة.
Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
BSA | Sigma | A-7030 | |
Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
NaOH | Sigma | 221465 | |
NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
Tris | Fisher | 04997-100 | |
Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
Methanol | EMS | 67-56-1 | |
Lead citrate | Leica | ||
Leica EM AFS | Leica | ||
Leica EM CPC | Leica | ||
Ultromicrotome | Leica | ||
JEOL 1200 EM | JEOL | ||
liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
Propane | Roberts Oxygen | ||
CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4000 |